新疆部分地區馬駑巴貝斯蟲病感染PCR 檢測調查

張夢圓,吾力江,姜 媛,宋晶晶,王盼舉,聞秀秀,王莉君,巴音查汗

(1.新疆農業大學動物醫學學院,新疆 烏魯木齊830052;2.新疆哈密市伊吾縣畜牧局畜牧工作站,新疆 烏魯木齊 839200)

駑巴貝斯蟲病是由駑巴貝斯蟲寄生于馬、騾、驢等馬屬動物體內的蜱傳血液原蟲病[1]。其蟲體大于紅細胞半徑,該病的臨床癥狀呈現稽留熱型、貧血、黃疸、血紅蛋白尿,部分急性病例會導致死亡。世界動物衛生組織(OIE)將其列為B 類疫病,我國將其列為二類疫病,該病呈全球性分布流行,具有很明顯的季節性,無周期性,且熱帶、亞熱帶地區居多,巴西、南非、土耳其等國均有報道;我國新疆、甘肅、內蒙古、吉林、廣州等地均存在馬駑巴貝斯蟲病相關報道[2]。據相關文獻報道共有3 屬14種的媒介蜱傳播該病,其中我國已查明可以傳播馬駑巴貝斯蟲的媒介蜱包括草原革蜱、銀盾革蜱、中華革蜱[3];銀盾革蜱是新疆駑巴貝斯蟲的傳播者。馬屬動物被攜帶有病原的媒介蜱叮咬后,駑巴貝斯蟲隨蜱蟲唾液進入馬屬動物血液內,寄生于馬屬動物的紅細胞內[4]。亞急性、慢性病例終身成為帶蟲宿主[5]。近年來新疆馬產業日益發展,隨著馬屬動物調用、運輸的頻繁,馬駑巴貝斯蟲病的感染也不斷增加,嚴重影響和制約著馬產業的發展。

為了解新疆部分地區馬匹感染馬駑巴貝斯蟲病情況,本試驗針對馬主產區采集樣品,通過PCR[6-7]方法對所采集的樣品DNA 進行病原檢測,并對結果進行差異情況分析,以便了解新疆馬駑巴貝斯蟲病的重疫區、威脅區、疑似區分布狀況和對新疆馬產業的危害程度,為該病的綜合防制奠定基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與保存 2016 年3-4 月和2017年4-5 月在北疆伊犁昭蘇種馬場、阿勒泰和吐魯番托克遜分別采集165 份、58 份和11 份血液,在南疆巴音布魯克牧場、和靜分別采集72 份和198 份血液,共計504 份。

1.2 主要試劑及實驗儀器 樹脂型TM 基因組DNA 提取試劑盒,購自北京賽百盛基因技術有限公司;PCR 擴增試劑,購自生工生物工程(上海)股份有限公司;T100TMThmal Cycler PCR 儀、Gel Doc 2000 紫外凝膠成像系統,購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 馬駑巴貝斯蟲全基因組核酸的提取 嚴格參照全基因組DNA 提取試劑盒操作說明書提取DNA,-20 ℃備用保存。

1.3.2 PCR 目的片段的擴增及序列比對分析 以提取的血液基因組DNA 為模板,參照瓦熱斯等[6]擴增馬駑巴貝斯BC48 基因的目的片段合成,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。馬駑巴貝斯蟲引物：

BC48-F：5′-GCGACGTGACTAAGACCTTATTGG-3′,BC48-R：5′-GTTCTCAATGTCAGTAGCATCCGC-3′,擴增特異性片段長為452 bp。采用13 μL 反應體系以全血基因組DNA 為模板,Mix 6.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA 模板2 μL,滅菌去離子水加2.5 μL。反應條件為95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s;56 ℃退火45 s;72 ℃延伸1 min;35 個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。陽性和陰性對照樣品DNA 由寄生蟲實驗室提供。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。將檢測的陽性樣品DNA 為模板,Mix 25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,DNA 模板3 μL,滅菌去離子水至50 μL。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳分離、純化目的片段,與pEASY-T1 Cloning Kit 載體連接,轉化E.coliDH5α 感受態細胞,于含氨芐青霉素的LB 固體培養基上培養12～16 h,挑單菌落于含氨芐青霉素5 mL LB 液體培養基中擴大培養,菌落PCR 檢測,陽性質粒送昆泰銳生物工程股份有限公司測序。序列經NCBI(BLAST)和GENETYX 軟件比對分析。

1.4 統計與分析 運用SPSS 19.0 軟件對不同地區不同年齡段馬感染馬駑巴貝斯蟲情況進行單因素方差分析。

2 試驗結果

2.1 PCR 方法擴增馬駑巴貝斯蟲結果 對馬血液基因組DNA 進行馬駑巴貝斯BC48 基因擴增,采用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳,獲得452 bp 的目的條帶,與預期片段大小相符,見圖1。

圖1 南北疆部分馬駑巴貝斯蟲BC-48 基因PCR 擴增結果

2.2 序列分析結果 測序結果經NCBI(BLAST)和GENETYX 軟件進行序列比對,擴增結果與3 個已知的駑巴貝斯蟲BC 48 基因序列比對,結果表明與JN217099.1 和KY111763.2 有3 個堿基不同,同源性為99%;與KY111764.2 有4 個堿基不同,同源性為99%,見圖2。

圖2 駑巴貝斯蟲BC 48 基因序列與已知序列比對分析

2.3 南北疆不同地區馬駑巴貝斯蟲感染結果 對北疆昭蘇種馬場、阿勒泰和吐魯番托克遜以及南疆和靜和巴音布魯克牧場所采集的樣品經PCR 檢測,結果表明,所檢測的504 份馬血液中有54 份為陽性,陽性率為10.71%(54/504)。其中北疆昭蘇種馬場、阿勒泰、吐魯番托克遜馬駑巴貝斯蟲陽性率分別為20.61%(34/165)、5.17%(3/58)、0(0/11);南疆巴音布魯克牧場、和靜馬駑巴貝斯蟲陽性率分別為0(0/72)、8.59%(17/198)。

2.4 不同年齡段馬駑巴貝斯蟲感染結果 對X≤3,3＜X≤6,6＜X≤9,X＞9 四個年齡段馬駑巴貝斯蟲感染情況進行檢測,4 個年齡段馬駑巴貝斯蟲感染率分別為9.76%、10.53%、11.21%和11.65%,見表1。

表1 不同年齡段馬駑巴貝斯蟲PCR 檢測結果

2.5 不同地區馬感染馬駑巴貝斯蟲情況單因素方差分析 針對北疆、南疆部分地區馬匹感染馬駑巴貝斯蟲情況使用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析。結果顯示,昭蘇種馬場與阿勒泰和巴音布克牧場存在極顯著性差異(P＜0.01);巴音布魯克牧場與和靜之間存在極顯著性差異(P＜0.01);昭蘇種馬場與吐魯番托克遜存在顯著性差異(P＜0.05),其余各地方差異不顯著(P＞0.05)。

2.6 不同年齡段馬駑巴貝斯蟲感染情況單因素方差分析 本次試驗對樣品采集地區的不同年齡段(X≤3,3＜X≤6,6＜X≤9,X＞9)馬駑巴貝斯蟲感染情況使用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析。結果表明,各個年齡段馬駑巴貝斯蟲感染無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論與小結

目前,國內對馬駑巴貝斯蟲病的診斷通常使用血液涂片、PCR、ELISA 等常規的檢測方法。血液涂片鏡檢法手段操作簡便直接,然而其針對涂片人員和涂片技術要求較高,染蟲率低時,漏檢的可能性大;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)在檢出帶蟲宿主[4]上是最好的一種血清學檢測方法;針對潛伏期和隱性感染階段,PCR 檢測方法應用普遍,敏感性、特異性較高,在基層檢測工作中,PCR 的方法更容易掌握和操作,結果可靠,易于推廣[7]。

本試驗主要通過對北疆昭蘇種馬場、阿勒泰和吐魯番托克遜以及南疆和靜和巴音布魯克牧場所采集的樣品用PCR 方法對馬駑巴貝斯蟲病原DNA 進行了檢測,并分析了不同地區、不同年齡段利用PCR 對馬駑巴貝斯蟲檢測結果,以期為不同疫區的放牧馬駑巴貝斯蟲病綜合防治奠定基礎。

馬駑巴貝斯蟲病在不同地區的流行情況均存在差異,這與當地宿主馬的分布、媒介蜱的出沒規律、流行因素等3 個環節有密切關系。在5 個不同的地區用PCR 方法的檢測結果中,北疆昭蘇種馬場馬駑巴貝斯蟲的陽性較高為20.61%(34/165),南疆和靜地區馬駑巴貝斯蟲陽性率8.59%(17/198)。與Xuenan Xuana[8]所分析的新疆本地馬駑巴貝斯蟲感染率為2.2%～38.7%結果一致。其中吐魯番托克遜牧場和巴音布魯克牧場的陽性率為0。經單因素方差分析后,發現昭蘇種馬場與阿勒泰和巴音布克牧場分別存在極顯著性差異(P＜0.01);巴音布魯克牧場與和靜也存在極顯著性差異(P＜0.01);昭蘇種馬場與吐魯番托克遜存在顯著性差異(P＜0.05),其余各地方差異不顯著。導致這一結果的原因可能是由于北疆昭蘇地處北疆伊犁河谷,氣候濕潤,植被豐富,馬產業發展規模較大。南疆和靜地區春季冷暖空氣交替頻繁并且多大風天氣,昭蘇地區的地理環境與和靜地區的氣候環境給蜱蟲孳生提供便利,而阿勒泰地區春季融雪較晚,巴音布魯克牧場地理位置獨特,分布著高寒草原,氣溫相對較低,不利于蜱蟲孳生。同時南北疆蜱種也存在很大的差異性。昭蘇種馬場與阿勒泰,巴音布克牧場;巴音布魯克牧場與和靜分別存在極顯著性差異(P＜0.01);吐魯番托克遜地區氣候干燥可能制約了蜱蟲的繁殖。所以,昭蘇種馬場與吐魯番托克遜存在顯著性差異(P＜0.05)。此外,吐魯番托克遜、阿勒泰、巴音布魯克牧場、和靜這幾個調查區域在地理位置上相互接近,地理環境相差不大,故馬駑巴貝斯蟲的感染率差異不顯著。馬駑巴貝斯蟲在新疆的總體感染情況呈北疆高于南疆,并且存有地方差異,這種分布特點將對其流行病學調查有著重要的意義,同時可為該病的監控提供方向。

參照朱玉濤,李永暢[9-10]年齡段劃分,并依據當地牧民放牧情況,對各地區的樣品進行年齡段劃分。在不同年齡段PCR 檢測結果中,4 個年齡段馬駑巴貝斯蟲感染率分別為9.76%、10.53%、11.21%和11.65%。X≤3 年齡段的感染情況低于其他年齡段,這可能與馬匹未接觸傳播蜱或自身免疫等原因有關。對4 個年齡段進行單因素方差分析后,發現各個年齡段馬駑巴貝斯蟲感染情況無顯著性差異。此結果與李永暢[10]所分析的結果一致。