高原牧區(qū)羊黑疫野毒分離株的生物學鑒定及免疫原性分析

李生慶,張西云,李淑萍,胡國元,王亭亭,劉懷新,葉明俊,賈 苗

(1.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院,青海 西寧810016;2.青海大學農牧學院動物醫(yī)學系,青海 西寧 810016)

諾維氏梭菌(Clostridium Novyi),是一種廣泛分布于自然界中的條件性致病菌,是革蘭染色陽性、兩端鈍圓的粗大桿菌。本病主要發(fā)生在肝片吸蟲流行的低洼潮濕地區(qū)。本病的發(fā)生經常與肝片吸蟲感染密切相關[1],主要集中在4 月份和9、10 月份,青海省海北州海晏縣和海西州烏蘭縣近幾年連續(xù)報道了由B 型諾維氏梭菌引起的大量羊只急性死亡[2-3],目前該病已廣泛分布于世界各地,嚴重危害各國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。

目前,對于該病主要采取疫苗免疫預防為主,然而,在本省曾多次發(fā)生免疫羊只發(fā)病的現象,我們推測可能是疫苗免疫原性及免疫保護不夠導致羊黑疫的連續(xù)發(fā)生,為了提高羊黑疫疫苗的免疫保護力,我們從青藏高原牧區(qū)病死羊體內分離的5 株野毒株中篩選具有高免疫原性的B 型諾維氏梭菌菌株,并進行16S rRNA 分子鑒定及菌株系統(tǒng)進化樹構建,通過產毒試驗及免疫試驗,篩選出具有代表性的1 株TB05 野毒菌株,研制成地方菌株羊黑疫菌苗,家兔及本動物免疫試驗證明,該菌具有良好的培養(yǎng)特性及免疫原性,可替代現有制苗用菌株。本試驗對高原牧區(qū)放牧綿羊羊黑疫的預防控制起到至關重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 TB05、WB1、S6、G4、HF 地方分離菌株均由本實驗室分離保存;C614,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試劑 細菌基因組DNA 提取試劑盒及質粒提取試劑盒,購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 實驗動物 昆明系小鼠,體重16～18 g,購自青海省地方病研究所小動物繁殖基地;試驗家兔,體重2～3 kg,購自青海省互助縣家兔養(yǎng)殖基地;試驗羊,體重20～25 kg,由青海省海北州順倉牛羊繁育基地提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將6 株B 型諾維氏梭菌接種于加生肝塊的自制VF 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)72 h,抹片鏡檢。

1.2.2 B 型諾維氏梭菌基因組DNA 提取、PCR 擴增及序列分析 基因組DNA 提取：取1.2 mL 上述7 株B 型諾維氏梭菌48 h 純培養(yǎng)物于1.5 mL 離心管中,12 000 r/min 離心1 min,棄取上清液,按DNA提取試劑盒要求提取基因組DNA。

基因組16S rRNA PCR 擴增：采用16S rRNA 通用引物P1 和P2,引物序列分別：P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;P2：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。以提取的7 株諾維氏梭菌基因組DNA 為模板進行PCR 反應。PCR 反應 在50 μL體系中進行,擴增條件為：95 ℃5 min、95 ℃30 s、54 ℃45 s、72 ℃1 min,30 個循環(huán)后,72 ℃延伸10 min。

PCR 擴增產物回收：利用OMEGA 公司購買的Gel Extraction Kit 按說明書提取目的片段,電泳檢測后送樣測序。并采用DNASTAR 軟件對基因序列進行同源性分析。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 通過NCBI 提供的BLAST 在線搜索服務軟件獲取其他產氣莢膜梭菌(魏氏梭菌、B 型諾魏氏梭菌)16S rRNA 基因組核酸序列。使用MEGA5.0 軟件的系統(tǒng)發(fā)育樹構建功能對基因序列進行分析,選擇鄰近法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析不同分離株諾維氏梭菌基因間的進化關系。

1.2.4 諾維氏梭菌α 毒素基因的PCR 擴增 根據GenBank 公布的B 型諾維氏梭菌α 毒素基因序列而設計一對引物P3 和P4,引物序列分別為：P3：5′-AAATTCAAGGAGGAATTTTA-3′;P4：5′-TTATGCTAACTTTAGCTGCGTC-3′;以提取的諾維氏梭菌基因組DNA 為模板進行PCR 反應。PCR 反應在50 μL 體系中進行,擴增條件為：94 ℃5 min、94 ℃1 min、58 ℃45 s、72 ℃1.5 min,30 個循環(huán)后,72 ℃延伸10 min。

1.2.5 菌種毒力測定 將上述經VF 培養(yǎng)基適應的6 株菌接種于未加生肝、含1.0%糖的VF 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)72 h,抹片、鏡檢,抽樣,4 000 r/min 離心20 min,遞倍稀釋后,小鼠靜脈注射測定毒力。

1.2.6 TB05 地方菌株菌苗的制備及免疫效果檢測 羊黑菌苗制備：利用高產毒TB05 地方菌株及C614 標準株進行大瓶培養(yǎng),72 h 后,按0.5%劑量加入甲醛,置于37 ℃殺菌、脫毒72 h,經無菌檢驗后,按菌液5 份+鋁膠1 份(每毫升菌苗含氫氧化鋁為7 mg 的量),充分混合,分裝待用。

家兔免疫攻毒試驗及血清抗體效價測定：取體重1.5～2.0 kg 健康兔44 只,分別用上述兩種自制疫苗免疫家兔0.1 mL、0.5 mL,每組皮下注射家兔4 只,免疫21 d 后,耳靜脈采血分離血清、并按家兔最小致死量300 MLD/mL(小鼠靜脈注射)攻毒,記錄死亡情況。

本動物免疫試驗：利用上述兩種疫苗各2 mL皮下注射綿羊10 只,羊只免疫21 d 及1、2、3 個月及6 個月后,頸靜脈采血3～5 mL,4 ℃冰箱過夜,待血清析出后,按組別吸出血清待用,測定血清效價。

2 結果

2.1 菌株形態(tài)觀察 在VF 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,革蘭染色呈陽性,菌體兩端鈍圓,呈粗桿狀(見中插彩版圖1);培養(yǎng)72 h 可見芽孢體。在含1.0%葡萄糖、pH 值8.4～8.6 的VF 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h,顯微鏡下為錯粗大的梭狀芽孢體(見中插彩版圖2)。

圖1 常規(guī)培養(yǎng)下的菌體形態(tài)

圖2 特殊培養(yǎng)條件下的菌體形態(tài)

2.2 諾魏氏梭菌基因組16S rRNA 基因擴增與序列分析結果

2.2.1 PCR 擴增結果 6 株產氣莢膜梭菌獲取的菌體DNA 經16S rRNA 通用引物PCR 后擴增,1.5%瓊脂糖凝電泳檢測,結果顯示,6 株菌均在1 450 bp 處出現條帶,與預期的片段大小一致(如圖3 所示)。

圖3 5 株地方分離菌株及標準株16S rRNA 擴增結果

2.2.2 基因組序列測定與同源性比較 將PCR 擴增得到的產物送北京賽百盛基因技術有限公司測序。并利用DNAStar 軟件將得到的序列與GenBank公布的B 型諾維氏梭菌參考毒株進行比對,并進行同源性分析,結果表明,其中的5 株菌的基因與參考菌株(Clostridium novyi)基因高度同源性均在99.5%以上(見圖4)。

圖4 基于B 型諾魏氏梭菌地方分離菌株16S rRNA 基因的系統(tǒng)進化樹

2.3 諾魏氏梭菌α 毒素基因的PCR 擴增結果 利用設計的B 型諾維氏梭菌α 毒素特異性引物,并以6 株菌獲得的DNA 為模板,采用PCR 擴增得到α毒素基因。從圖5 可以看出,PCR 產物α 毒素基因大小為530 bp,與實驗設計相符,說明6 株菌均為B型諾維氏梭菌。

2.4 菌種毒力測定 6 株B 型諾維氏梭菌在同一培養(yǎng)條件下的產毒素能力如圖6 所示,其中TB05地方菌株產毒能力最高,平均可達40 000 MLD/mL,與其他菌株的產毒能力差異極顯著(P＜0.01)。

2.5 菌苗免疫效力檢驗

2.5.1 免疫家兔血清抗體效價測定 TB05 磷酸鋁苗0.5 mL 免疫組0.1 mL 血清最高可中和300 個MLD(小鼠最小致死量),而對照組最高只能中和100 個MLD;TB05 磷酸鋁苗0.1 mL 免疫組0.1 mL血清最高可中和200 個MLD(小鼠最小致死量),而對照組最高只能中和100 個MLD(見圖7)。

圖5 5 株地方分離菌株及標準株α 毒素PCR 擴增結果

圖6 不同菌株的產毒素能力對比

圖7 兩種菌苗免疫家兔體內血清抗體效價比較

2.5.2 綿羊免疫血清抗體測定結果 免疫21 d 后,0.1 mL 血清可中和大于400 MLD/mL(小鼠最小致死量),免疫180 d 后0.1 mL 血清仍可中和50 MLD/mL。而對照組免疫21 d 后,0.1 mL 血清只能中和大于50 MLD/mL(小鼠最小致死量),在3 個月后,基本無保護效力,差異顯著(見圖8)。

圖8 免疫羊體內血清抗體效價變化

3 討論

疫苗制備過程中,高產毒菌株的篩選至關重要。本研究先通過對青藏高原牧區(qū)病死羊病料中分離的B 型諾韋氏梭菌進行細菌生物學特性分析,分析了a 毒素基因序列并構建了16S rRNA 的系統(tǒng)進化樹,系統(tǒng)發(fā)育樹表明5 株地方菌株與標準菌株C614 相距很近,說明親緣性非常高。之后通過大量的試驗,比較5 株病原菌株的致病力差異,產毒量差異,最終篩選出產毒量最高培養(yǎng)穩(wěn)定、免疫原性好的TB05 菌株作為疫苗候選株。

在由產氣莢膜梭菌所引起的眾多家畜“猝死癥”的研究報道中,外毒素一直被認為是致動物死亡的主要原因之一[4]。B 型諾維氏梭菌α 毒素是造成動物死亡的主要毒素,在20 世紀中葉,很多科研工作者開始致力于探索疫苗接種用于預防產氣莢膜梭菌病的可能性。α 類毒素的研究始于20 世紀30 年代,大約在二戰(zhàn)時期達到頂峰[5]。此種病的免疫關鍵在于動物體內抗毒素水平的高低,因此在生產B 型諾維氏梭菌滅活疫苗時,首先要求制苗菌液中毒素的毒力達到一定標準,才能得到高效疫苗,獲得良好的免疫效果。本研究對分離自高原牧區(qū)的5 株野毒菌株及1 株標準菌株的產毒能力進行了對比分析,在合適的培養(yǎng)基上,TB05 野毒菌株的產毒能力遠遠高于其他菌株的產毒能力,且產毒穩(wěn)定性高,平均能達到4 萬MLD/mL,遠高于現用疫苗規(guī)程規(guī)定的4 000～10 000 MLD/mL 的產毒最低要求[6],用此菌株所產毒素制成的羊黑疫疫苗其對家兔及綿羊的免疫保護力同樣優(yōu)于對照組的現用疫苗的保護力。證明該野毒菌株具有替代現用羊黑疫疫苗生產菌株的潛在趨勢。

諾維氏梭菌雖同屬于產氣莢膜梭菌,但其培養(yǎng)及產毒特性與其他菌存在明顯差異,本試驗在確定了疫苗候選株之后,對培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基成分進行了摸索和改良。本試驗通過對產毒過程的觀察以及間斷性取樣檢測及毒力測定,確定在培養(yǎng)后72 h 作為抗原的收獲時間。其次,通過不同pH 值對產毒的影響試驗測得,該菌株最適產毒pH 值在8.2～8.4,這與報道,pH 值6.5～7.5 是產氣莢膜梭菌生長和毒素產生的最佳pH 值條件[7]有一定差異。

同時,通過不同碳源加入量對產毒的影響試驗,測得在含1.0%葡萄糖的培養(yǎng)基上,產毒最高,這與文獻報道的易消化的碳水化合物像葡萄糖或糊精,均可提高產氣莢膜梭菌產毒量[8]的論述相一致。

由于該菌導致的疫病具有發(fā)病急、病程短、死亡率高等特點,藥物治療很難達到效果,因此疫苗預防是控制該病的主要手段[9]。20 世紀80 年代初,我國成功研制出產氣莢膜梭菌病的單價苗和多聯滅活疫苗,在預防由產氣莢膜梭菌引起的疫病方面發(fā)揮了重要作用。如中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所文希韶等,在浙江杭嘉地區(qū)發(fā)生的急性傳染病采集病原菌,研制了綿羊(湖羊)黑疫快疫混合疫苗,3 批苗免疫羊除第3 批1 只羊未保護外,2 mL 免疫劑量可抵抗100 MLD 攻毒劑量,免疫效果良好[10]。本試驗中,利用TB05 地方菌株制備的羊黑疫菌苗免疫21 d 后,0.1 mL 血清可中和大于400 MLD/mL 的毒素量,免疫效果更佳。因此,該地方菌株可作為生產羊黑疫疫苗的備用菌株。