牛羊場環境氣載葡萄球菌濃度及氣溶膠粒譜特征分析

劉家祺,白燕雨,熊云梅,郭 耀,喬婷婷,段晉偉,唐 芳,霍乃蕊,古少鵬

(山西農業大學動物科技學院,山西 太谷 030801)

葡萄球菌廣泛分布在空氣、水和土壤環境中,健康動物的體表和呼吸道中也存在大量的葡萄球菌,感染人、畜后以化膿性炎癥為主要特征。牛葡萄球菌病多發于奶牛,引起急慢性乳腺炎,導致生產力嚴重受損[1];羊體表、呼吸道及消化道受到葡萄球菌(主要是金黃色葡萄球菌)感染一般會引起毛囊炎、皮下膿腫、食物中毒、胃腸炎、氣管炎及肺炎等疾病[2]。目前,我國牛、羊養殖業由傳統的散養向集約化、工廠化發展,高密度養殖方式加劇了養殖環境的污染,大量的致病性及非致病性細菌氣溶膠極易直接或間接引發人、畜的各類疾病[3],動物圈舍內、外細菌氣溶膠來源復雜,畜禽自身、糞便、飼料和墊草及空氣中懸浮物均可形成細菌氣溶膠,威脅動物與養殖場周邊居民健康[4]。本試驗檢測了牛、羊場及外環境四季氣載葡萄球菌濃度變化,以及葡萄球菌氣溶膠粒譜特點,以期為牛、羊場氣載葡萄球菌危害評估和養殖環境控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 牛、羊場概況 牛場：奶牛舍為半開放式,設有運動場,每棟牛舍飼養奶牛100 頭,采用自然通風采光。飼養量300 頭,專人每天打掃衛生,消毒1 次/周。羊場：羊舍結構為半開放式,無運動場,高床平養,自動出糞,飼養密度為0.5 只/m2,每棟飼養量500 只,自然通風結合風機換氣。

1.2 采樣地點 分別于牛舍外的上風向10 m、下風向10 m、下風向50 m 及下風向100 m 處各選取1個采樣點;牛舍內選取3 個采樣點;奶牛運動場選取3 個采樣點;在羊場外上風向10 m、下風向10 m、下風向50 m 及下風向100 m 處各選取1 個采樣點;羊舍內選取3 個采樣點。

1.3 主要試劑及儀器 普通營養瓊脂(北京奧博星生物技術責任有限公司,02-276);Baird-Park 瓊脂培養基(青島海博生物公司,HB4115);營養肉湯(Solarbio,N8300);脫纖維綿羊血;Andersen 6 級空氣生物收集器(Tisch environment,USA),捕獲粒子直徑范圍見表1。

表1 Andersen-6 級采樣器捕獲粒子直徑范圍

1.4 空氣樣本采集 應用Andersen-6 級空氣微生物收集器分別于春、夏、秋、冬四季中連續3 d 采集牛羊場及周圍環境的空氣樣本,并記錄當時的氣溫、相對濕度及風速等環境參數,采樣介質為5%綿羊血瓊脂,模擬牛、羊呼吸高度進行采樣,采樣流量28.3 L/min,采樣時間為3 min,每點3 次重復,并設空白對照。

1.5 樣本的處理(1)分離培養將采樣后的5%綿羊血瓊脂平板置于37 ℃恒溫培養箱內,倒置培養24～48 h。用無菌接種環挑取血平板上的全部菌落,革蘭染色鏡檢后,將鏡檢為葡萄串狀的革蘭陽性菌株,接種到BP 培養基上,將生長邊緣淡灰色到黑色的菌落計為葡萄球菌;(2)菌落計數依據5%綿羊血瓊脂平板生長的菌落數,計算每立方米空氣中所含需氧菌及葡萄球菌總數(CFU/m3),計算公式如下：每立方米空氣中所含的細菌總數=六級平皿上細菌數÷28.3 L/min×采樣時間(min)×1 000。

1.6 數據統計與分析(1)空氣中微生物呈非正態分布,本試驗氣載葡萄球菌含量均使用中間值表示,此統計方式適合此統計方式適合運用在數值較小但波動較大的樣本統計,并用最大值和最小值反應各樣本之間數值的波動范疇[5],平均值為中間值的平均數。中間值計算公式：

若n為奇數,則Md=X(n+1)/2;若n為偶數,則Md=(Xn/2+Xn/2+1)/2。

(2)細菌氣溶膠粒譜特征以計數中值直徑(CMD)表示,細菌粒徑分布的離散度以幾何標準差GSD 表示,人的通氣量按6.94×10-3m3/min 計算,牛通氣量按1.44×10-1m3/min[6],羊的通氣量按5.70×10-3m3/min 計算[7]。

Andersen-6 級空氣采樣器第Ⅰ、Ⅱ級收集的細菌粒子直徑＞6 μm,可進入人畜淺部呼吸道,第Ⅲ～Ⅵ級收集的細菌粒子直徑≤5 μm,可沉著在細支氣管甚至直接進入肺泡[8]。可進入呼吸道淺部、深部的細菌粒子量分別對應采樣器的第Ⅰ、Ⅱ級和第Ⅲ～Ⅵ級。

2 結果

2.1 牛、羊場環境空氣中葡萄球菌的濃度

2.1.1 牛場空氣中葡萄球菌的濃度 牛場四季環境氣載葡萄球菌濃度在0.16×103CFU/m3～4.43×103CFU/m3之間,冬季濃度最高,夏季次之,春季最低,在牛舍、運動場、上風向10 m、下風向10 m、下風向50 m 和下風向100 m 處氣載葡萄球菌占氣載需氧菌的比例分別為79.14%、71.63%、55.93%、55.93%、62.40%、63.41%。牛舍、運動場、上風向10 m、下風向10 m、下風向50 m 和下風向100 m氣載葡萄球菌濃度分別為1.15×103CFU/m3～4.43×103CFU/m3、1.22×103CFU/m3～4.27×103CFU/m3、0.16×103CFU/m3～0.5×103CFU/m3、0.56×103CFU/m3～1.23×103CFU/m3、0.49×103CFU/m3～1.07×103CFU/m3、0.27×103CFU/m3～0.75×103CFU/m3,氣載葡萄球菌濃度平均值以牛舍最高,上風向10 m 處最低,在牛舍下風向處的氣載葡萄球菌含量隨著與圈舍距離增大而逐漸減小,見圖1。

圖1 牛場氣載葡萄球菌含量

2.1.2 羊場空氣中葡萄球菌的濃度 羊場四季環境氣載葡萄球菌濃度在0.22×103CFU/m3～4.82×103CFU/m3之間,夏季濃度最高,冬季次之,春季最低,羊舍、上風向10 m、下風向10 m、下風向50 m 和下風向100 m 氣載葡萄球菌占氣載需氧菌的比例分別為74.86%、67.16%、59.30%、67.83%、68.97%。羊舍、上風向10 m、下風向10 m、下風向50 m 和下風向100 m氣載葡萄球菌濃度分別為1.27×103CFU/m3～4.82×103CFU/m3、0.22×103CFU/m3～0.81×103CFU/m3、0.74×103CFU/m3～1.96×103CFU/m3、0.28×103CFU/m3～1.5×103CFU/m3、0.27×103CFU/m3～1.19×103CFU/m3,氣載葡萄球菌濃度平均值以羊舍最高,上風向10 m 處最低,羊舍下風向處的氣載葡萄球菌含量隨著與圈舍距離增大而逐漸減小,見圖2。

圖2 羊場氣載葡萄球菌含量

2.2 牛、羊場環境氣載葡萄球菌的空氣動力學特征

2.2.1 牛場環境葡萄球菌氣溶膠顆粒空氣動力學特點 牛場環境中葡萄球菌氣溶膠顆粒主要分布在采樣器的第Ⅵ、Ⅴ級,峰值均出現在第Ⅵ級(2.1～3.3 μm),次峰均在第Ⅴ級(1.1～2.1 μm),第Ⅲ～Ⅵ級占比為72.89%～84.73%,見圖3。

圖3 牛場各采樣點氣載葡萄球菌在采樣器上的分布

2.2.2 羊場環境葡萄球菌氣溶膠顆粒空氣動力學特點 羊場環境中氣載葡萄球菌主要分布在采樣器的第Ⅰ、Ⅳ級,峰值均出現在第Ⅰ級(＞7 μm),次峰均在第Ⅳ級(2.1～3.3 μm);第Ⅲ～Ⅵ級占比為53.33%～62.75%,見圖4。

圖4 羊場各采樣點氣載葡萄球菌在采樣器上的分布

2.2.3 葡萄球菌氣溶膠粒子CMD 和GSD 值 牛場環境葡萄球菌氣溶膠粒子CMD 值為2.30 μm～2.67 μm,其中牛舍最低;GSD 為1.85～1.92;羊場環境的葡萄球菌氣溶膠粒子CMD 值為3.09 μm～3.56 μm,其中羊場下風向10m 處最低;GSD 為1.68～1.84。

2.2.4 到達人畜呼吸道不同部位的葡萄球菌粒子量 在牛舍中,人和牛每分鐘可吸入至肺部深處的葡萄球菌粒子量最高可達16.29 CFU 和337.97 CFU,高于其他采樣點,并且在下風向處隨著與牛舍距離增大,人畜每分鐘可吸入至肺部的葡萄球菌粒子量逐漸減小,詳見表2。

表2 牛場環境氣載葡萄球菌在呼吸道不同部位的到達量 (CFU/min)

在羊舍中,人和羊每分鐘可吸入至肺部深處的葡萄球菌粒子量最高可達11.28 CFU 和9.26 CFU,高于其他采樣點,并且在下風向處隨著與羊舍距離增大,人畜每分鐘吸入至肺部的葡萄球菌粒子量逐漸減小,見表3。

表3 羊場環境氣載葡萄球菌在呼吸道不同部位的到達量 (CFU/min)

3 討論

3.1 牛、羊舍環境四季氣載葡萄球菌濃度 牛舍內氣載葡萄球菌含量冬季最高,春季最低,與冬季舍內密封較嚴、風速小、濕度大,舍內通風換氣慢,環境適宜葡萄球菌生長有關;春季風速較大,空氣流動快,舍內濕度小,氣載葡萄球菌含量較低。我們測得牛舍內氣載葡萄球菌濃度平均值為2.77×103CFU/m3,遠高于段會勇[9]兔舍氣載葡萄球菌含量均值2.74×102CFU/m3的測定結果,柴同杰[10]指出的無墊草奶牛舍氣載需氧菌濃度應低于2.5×103CFU/m3,葡萄球菌屬需氧菌,該牛舍氣載需氧菌含量必定超出此界值,需改善環境衛生。

羊舍內氣載葡萄球菌濃度夏季最高,春季最低,本試驗研究對象是舍飼羊場,羊舍夏季氣溫較高,舍內通風差,葡萄球菌濃度較高;春季風速大,舍內無動力風機運轉較快,環境衛生得到改善。關于羊舍氣載需氧菌的最低限量,目前未見報道,但羊舍內氣載葡萄球菌含量均值為2.59×103CFU/m3,遠高于一般環境。

養殖場氣載葡萄球菌濃度夏冬兩季較高,春季最低,這與鐘召兵[11]研究一致。葡萄球菌是主要的環境細菌,在本試驗發現牛、羊舍內氣載葡萄球菌含量較高,Crowe[12]等認為,環境中高濃度的氣載微生物可造成動物和人員的抵抗力和免疫力下降,對傳染性疾病易感性增強,因此必須注重圈舍空氣的清潔和消毒。

3.2 牛、羊場氣載葡萄球菌的散播 本試驗表明,牛、羊舍及其下風向處氣載葡萄球菌的含量均隨距離養殖場的距離逐漸增大而減小,散播距離超過100 m;柴同杰等[13]在雞舍下風向(10～400 m)分離的57.1%金黃色葡萄球菌與舍內空氣與糞便樣本中采集的相同;黃藏宇[14]的研究顯示,豬舍內氣載需氧菌含量與舍外下風向10 m、20 m、25 m 和30 m處空氣無明顯差異,以上均表明動物圈舍內氣載葡萄球菌可向舍外較大距離散播。圈舍內衛生、飼養密度以及風速、風向等因素均會影響舍內微生物氣溶膠傳播的距離與強度[15],因此養殖場建設時選址應與居民區保持一定距離。

3.3 牛、羊場氣載葡萄球菌空氣動力學分析 本試驗中使用的Andersen-6 級微生物收集器可根據空氣中微生物顆粒直徑大小不同而采集在不同的級上,采樣器模擬呼吸道可判斷微粒到達部位,收集在第Ⅰ、Ⅱ級上的微粒能夠侵入鼻咽喉及氣管,收集在采樣器第Ⅲ到Ⅵ級上的微粒能夠沉著在支氣管和細支氣管最終進入肺泡中[16-17]。所以,依據空氣中微生物到達的采樣器的不同級,可模擬微粒到達呼吸系統的部位,從而推斷氣載微生物對人畜健康的威脅程度。

本試驗測定結果表明,牛舍內氣載葡萄球菌的40.39%、30.54%散布在Andersen-6 級收集器的第Ⅳ、Ⅴ級上,84.73%分布在Andersen-6 級采樣器的第Ⅲ到Ⅵ級上,這一部分葡萄球菌能到達人、畜深部呼吸道和肺泡。羊場內氣載葡萄球菌的22.55%分布在采樣器第Ⅳ級,分布在采樣器第Ⅲ到Ⅵ級的氣載葡萄球菌占總數的62.75%。李曉霞[18]等對國內醫院室內耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的粒度分布研究發現,超過50%的氣載金黃色葡萄球菌及其中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均分布在采樣器第Ⅲ～Ⅵ級,可直接到達肺部引起感染;于歡[19]等發現,羊舍真菌氣溶膠80%分布在采樣器第Ⅲ～Ⅴ級,可引起肺炎及毒素中毒;Kim[20]等也認為吸入分布在采樣器第Ⅲ～Ⅵ級的微生物后會對人類健康產生嚴重危害。

牛場及外環境的葡萄球菌氣溶膠粒子CMD 值均小于3 μm,且牛舍處最高,提示牛場及外環境葡萄球菌氣溶膠粒子可進入人和牛呼吸道深部甚至肺泡的葡萄球菌氣溶膠粒子比例最大,粒徑分布離散度GSD 較小,說明大量的葡萄球菌可到達人畜呼吸系統深部;羊舍及外環境的葡萄球菌氣溶膠粒子CMD 值接近3 μm,且各采樣點的GSD 值相差較小,提示羊場氣載葡萄球菌可進入人畜呼吸道深部的數量大、濃度高,危害性較大。