千金子對腎癌Renca細胞周期及侵襲能力的影響

趙俊峰 李豪 肖耀軍 雷震 張林超 孫繼建 潘世杰 崔洪泉 陳瑞廷

(1河南省中醫院 河南中醫藥大學第二附屬醫院泌尿外科，河南 鄭州 450002；2武警廣東總隊醫院泌尿外科，3河南省中醫院 河南中醫藥大學第二附屬醫院中心實驗室)

腎細胞癌(RCC)為泌尿系統常見的惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤3%～5%，其發病率有逐年上升趨勢〔1〕。即使通過外科手術治療，仍有20%～40%的患者在術后發生侵襲和遠處轉移〔2,3〕。因此尋找中藥治療腎癌成為熱點,其中千金子為大戟科類干燥以后成熟的種子，現代藥理學研究已經表明其對腎癌〔4〕、肝細胞癌〔5〕、前列腺癌〔6〕及血液系統的惡性腫瘤細胞〔7〕均具有不同程度的抗腫瘤效果。本研究以小鼠腎癌Renca細胞為實驗對象，通過體外細胞實驗檢測千金子對腎癌細胞周期的影響及其侵襲轉移能力的影響，為后續的實驗研究提供依據。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 千金子二萜醇實驗用藥品購買自四川維克奇生物科技有限公司，純度為99%(批號：20190023)；胎牛血清、RPMI-1640細胞培養基、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；雙抗(青霉素、鏈霉素)購買自武漢漢恒生物科技有限公司；細胞6孔板和Transwell小室均購自美國Corning公司；AnnexinV-FITC細胞周期的試劑盒購買自上海碧云天生物科技有限公司。小鼠腎癌Renca細胞購自北京鼎國昌盛生物科技有限公司，由河南中醫藥大學第二附屬醫院中心實驗室保存。

1.2方法

1.2.1細胞培養 小鼠腎癌Renca細胞放置在含5%CO2、37℃的細胞恒溫箱中，含有雙抗(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養基常規培養，待細胞飽和度達到80%～85%后，使用胰蛋白酶消化細胞后并進行傳代培養，取對數生長期的細胞用于本實驗。

1.2.2千金子作用前后對腎癌Renca細胞形態學的影響 取預先復蘇的細胞，使用含有0.25%的胰蛋白酶消化細胞后，調整細胞的濃度為3×105/ml，并接種到6孔板中。常規的條件下培養24 h后，等細胞完全貼壁，換液1次，實驗孔滴加預先稀釋的千金子二萜醇，對照孔滴加等量的培養基。培養24～48 h后，于倒置顯微鏡下隨機拍照，記錄細胞形態學的變化。

1.2.3劃痕實驗檢測千金子對腎癌Renca細胞遷移能力的影響 取對數期生長的細胞，用含有0.25%的胰蛋白酶消化后收集腎癌Renca細胞，隨即接種到6孔板中密度為1×105/孔，待細胞貼壁后，使用無血清培養基饑餓6 h，用200 μl的槍頭垂直于6孔板劃“1”字形的劃痕，再用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次。加入濃度為(9 000 μg/ml)的千金子二萜醇，以加入培養基組作為對照組。在劃痕時開始和千金子處理24 h后，在倒置顯微鏡下觀測劃痕的寬度并拍照。

1.2.4Transwell小室檢測千金子對腎癌Renca細胞侵襲轉移能力的影響 采用Transwell小室法體外遷移實驗觀察和處理48 h后腎癌Renca細胞遷移能力的變化，同樣取對數生長期腎癌細胞，經胰蛋白酶消化細胞后，收集細胞調整細胞密度為1×105/ml，PBS水化小室的基底膜，同時向小室下層內添加500 μl不含胎牛血清的RPMI-1640細胞培養基，小室膜上均加入100 μl細胞懸浮液。實驗組滴加9 000 μg/ml的千金子二萜醇溶液，對照組滴加培養基。放置于37℃、5%CO2飽和濕度細胞恒溫箱中培養48 h后，用含4%的多聚甲醛固定30 min、0.1%的結晶紫染色20 min以后，并取出里邊的小室，擦去沒有穿過小室膜的細胞，在顯微鏡下，隨機取5個視野(上、下、左、右、中間)觀察Transwell小室并進行細胞計數，實驗的結果取均值，并獨立重復3次。

1.2.5細胞增殖周期的檢測 取對數生長期的腎癌Renca細胞，用單純RPMI1640調整細胞密度為2×105/ml，均勻加樣于6孔板中置于細胞恒溫培養箱中常規培養24 h貼壁后備用。實驗組加入千金子二萜醇(9 000 μg/ml)，對照組加入體積分數為10%胎牛血清的RPMI1640培養基，預處理細胞；常規培養24 h后，收集各孔細胞。用預冷的PBS沖洗細胞2次后，將細胞重懸于0.5 ml PBS液中，迅速注入75%的預冷乙醇(4℃)冰箱固定過夜。測定時離心棄上清液2次，將細胞重懸于0.5 ml的PBS液中，加入0.5 ml的碘化丙啶(PI)溶液(含10 mg/L的RNase、0.1%Triton-100、50 mg/L PI)4℃避光染色30 min,經過尼龍網過濾以后，上流式細胞儀檢測細胞周期，所得實驗結果利用Modfit軟件分析。試驗獨立重復3次。

1.3統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1千金子對腎癌Renca細胞形態學的影響 9 000 μg/ml的千金子二萜醇作用于腎癌Renca細胞24 h后，大部分細胞體積變小、變細短圓鈍；部分細胞出現凋亡的特征，細胞內出現凋亡小體，有細胞碎片漂浮。見圖1。

圖1 千金子對腎癌Renca細胞形態學的影響(×100)

2.2千金子對腎癌Renca細胞侵襲與轉移能力的影響 千金子二萜醇處理腎癌Renca細胞48 h后，穿過小室膜的細胞數量〔(116.51±15.26)%〕與對照組〔(563.23±39.61)%〕比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3千金子對腎癌Renca細胞遷徙能力的影響 與對照組相比較，實驗組腎癌細胞的遷移距離明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2及表1。

圖2 千金子對腎癌Renca細胞遷徙能力的影響(×100)

表1 千金子對Renca細胞遷移距離的影響

與對照組比較：1)P<0.05，下表同

2.4千金子對腎癌Renca細胞周期的影響 與對照組比較，實驗組細胞G0/G1期細胞明顯增加，S期細胞明顯減少(P<0.05),G2/M期的細胞無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 千金子對腎癌Renca細胞周期的影響

3 討 論

本研究基于前期發現中藥千金子二萜醇濃度為9 000 μg/ml時對小鼠腎癌Renca細胞存在明顯的抑制作用〔8〕，更進一步探討其對腎癌細胞周期和侵襲轉移能力的影響。腫瘤是細胞增殖周期調控機制出現紊亂，最終導致細胞無限制地進行分裂增殖。在臨床上抗腫瘤藥物的機理有許多是通過阻斷腫瘤細胞的分裂周期從而抑制癌細胞的增殖。Choene等〔9〕研究發現千金子乙醇提取物作用于人腎癌細胞后，G2/M期的細胞數量明顯增加，隨著藥物濃度提高處于G0期細胞數量隨之增多。本實驗結果顯示，千金子可以使小鼠腎癌Renca細胞G0/G1期細胞明顯增加，S期細胞數量減少，G2/M期細胞無明顯變化。Cheng等〔4〕研究中藥千金子作用于乳腺癌(mda-mb 231)等細胞株后，處于G0/G1期細胞數量顯著增多，與本研究的結果一致，表明中藥千金子在不同的細胞引起細胞周期的阻滯可能并不完全一致。此外，癌細胞侵襲與轉移是影響預后的另一重要的因素，也是腫瘤治療失敗的主要原因。本研究通過Transwell小室實驗及體外細胞劃痕實驗，與對照組相比較，發現千金子可以有效降低腎癌Renca細胞侵襲、轉移和遷徙的能力。另外，Yang等〔10〕的研究結果也表明千金子通過抑制人肺癌A549細胞腫瘤血管的生成來阻斷其侵襲和轉移，與本研究的結果基本相符。近年來研究表明PI3K-AKT-mTOR信號傳導通路廣泛存在于多種細胞中，完成并參與細胞包括增殖、分裂、凋亡、侵襲、轉移及血管生成等生物學行為〔11,12〕；該信號通路的表達失控與多種癌細胞的發生發展有關，針對PI3K-AKT-mTOR信號通路分子靶向治療成為當前研究的熱點〔13〕。千金子與通過該信號通路調控腎癌Renca細胞生物學行為的分子機制之間的關系，有待后續的研究。