Toll樣受體2基因敲除通過myd88依賴的p38MAPK減輕高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織氧化應激

宋冰 王茹 張浩強

(1錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121000；2錦州醫科大學研究生學院)

隨著患病率逐年增高，肥胖已經成為世界性難題〔1，2〕，它可以引起胰島素抵抗、2型糖尿病、心臟病、終末期腎病甚至是某些癌癥等一系列疾病〔3〕。肥胖機體脂肪組織存在低水平的炎癥反應〔4〕及氧化應激〔5〕在肥胖發生發展中的作用已經被廣泛研究，近年來高游離脂肪酸(FFA)能夠激活Toll樣受體(TLR)2越來越引起研究者的關注，FFA激活TLR2后可層層激活包括myd88依賴的炎癥通路而引起下游炎癥因子的表達〔6〕，而包括腫瘤壞死因子(TNF)-α在內的炎癥因子表達和氧化應激反應密切〔7〕，本實驗利用高脂飲食誘導肥胖小鼠，并檢測肥胖小鼠脂肪組織炎癥因子以及氧化應激狀態的改變，然后再利用高脂飲食喂養的TLR2基因敲除的小鼠探究TLR2基因敲除對肥胖小鼠脂肪組織炎癥因子表達和氧化應激狀態的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物分組 SPF級健康4周齡雄性C57bl/6小鼠和TLR2基因敲除小鼠各24只，隨機分為正常對照組(NC組)(8只)，高脂飲食組(HFD組)(16只)，TLR2基因敲除肥胖組(TK組)和TLR2基因敲除高脂飲食組(TH組)。NC組和TK組給予普通飲食(華阜康，北京)，HFD組和TH組給予含60%脂肪的高脂飲食(華阜康，北京)。16 w后HFD組隨機挑選8只體重大于NC組上限納入肥胖組(OB組)，TH組隨機挑選8只體重大于TK組上限者納入TO組(TO組)用于實驗，其余剔除。各組小鼠飼養于錦州醫科大學附屬第一醫院實驗動物中心，所有動物實驗符合錦州醫科大學倫理委員會規定。

1.2生化指標檢測 各組小鼠禁食6 h，心臟取血，檢測空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和FFA。

1.3Western印跡 動物處死后速取腹腔脂肪組織，-80℃冰箱儲存備用，冰上取100 mg脂肪組織，剪碎后加裂解液裂解(RIPA∶PMSF=100∶1)，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒(博奧森，北京)定量至2 mg/ml，聚丙烯酰胺凝膠電泳，賽默飛Marker標注蛋白位置，濕轉蛋白及Marker至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，TLR2(博奧森，北京)，myd88(萬類，沈陽)，p38MAPK(博奧森，北京)和β-actin(ABSCI，美國)一抗4℃孵育過夜，過氧化物酶標記的二抗(ABSCI，美國)常溫孵育2 h，超敏電化學發光(ECL)試劑盒(萬類，沈陽)及GISt020凝膠圖像分析儀成像。

1.4熒光實時定量PCR 腹腔脂肪組織總RNA采用Trizol抽提，含反轉錄酶的反轉錄試劑盒(Bioneer，韓國)反轉錄mRNA為cDNA，QIAGEN Fast Cycling PCR 試劑盒(Takara生物科技，大連)用于擴增：按照95℃(預變性，10 s；變性5 s)，60℃(退火，15 s)，70℃(拉伸，15 s)進行擴增45個循環。引物由上海生工設計并合成，白細胞介素(IL)-6：正義5′-ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3′，反義5′-CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3′；TNF-α：正義5′-TGTCTCAGCCTCTTCTCATT-3′，反義5′-AGATG-ATCTGAGTGTGAGGG-3′；GAPDH：正義5′-TTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3′，反義5′-GGATAGG-GCCTCTCTTGCTCA-3′，所得數據以GAPDH作為內參，計算IL-6和TNF-α基因的相對拷貝數，相對拷貝數用2-△△Ct表示。

1.5氧化應激檢測 脂肪組織1∶20的比例加入100 mmol/L磷酸緩沖液勻漿后離心(12 000 r/min)10 min，取中層清液，BCA定量如上，調整蛋白濃度至2 mg/ml后，活性氧簇(ROS)檢測試劑盒(萬類，沈陽)檢測活性氧含量。丙二醛(MDA)檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(建成生物研究所，南京)檢測MDA含量和SOD活力。

1.6統計分析 析因設計分析交互作用，單因素方差分析組間差異，數據處理采用SPSS20.0軟件。

2 結 果

2.1生化指標 與NC組相比，OB組小鼠FPG，TC，TG，LDL和FFA明顯升高(P<0.01)，HDL明顯降低(P<0.01)。與OB組相比，TO組FPG，TC，TG，HDL，LDL和FFA均降低(P<0.01,P<0.05)，且TLR2基因敲除和高脂飲食喂養之間存在交互作用(表1)。

表1 各組血脂、血糖、FFA水平比較

與NC組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與OB組比較：3)P<0.01，4)P<0.05；與TK組比較：5)P<0.01，6)P<0.05，下表同

2.2Western印跡 與NC組相比，OB組小鼠TLR2、myd88和p38MAPK蛋白水平明顯升高(P<0.01)；而與OB組相比，TO組myd88和p38MAPK明顯降低(P<0.01)，見圖1、表2。

圖1 TLR2，myd88，p65nfkb和p38MAPK蛋白相對表達量

組別TLR2myd88p38MAPKNC組0.22±0.030.72±0.0150.26±0.04OB組0.73±0.041)1.02±0.061)0.48±0.031)TK組-0.75±0.070.13±0.01TO組-0.86±0.113)0.17±0.013)

2.3實時熒光定量PCR 與NC組相比，OB組小鼠脂肪組織IL-6和TNF-α mRNA水平明顯升高，與OB組小鼠相比，TO組小鼠脂肪組織IL-6和TNF-α mRNA水平明顯降低，且TLR2基因敲除和高脂飲食喂養對其影響存在交互作用(P=0.000)，見表3。

2.4氧化應激指標檢測 與NC組相比，OB組小鼠脂肪組織ROS和MDA水平明顯升高，SOD活力水平明顯降低，與OB組小鼠相比，TO組小鼠脂肪組織ROS和MDA水平明顯降低，SOD活力明顯增加，見表4。

表3 各組TNF-α、IL-6 mRNA表達量比較

表4 各組脂肪組織氧化應激指標水平比較

3 討 論

近年來超重和肥胖已經越來越成為亟待解決的問題〔1，8〕。肥胖機體中的高水平FFA可以刺激TLR2而層層激活炎癥，刺激炎癥因子的表達〔6〕，我們猜想，在高脂飲食誘導的肥胖小鼠體內可能存在TLR2及其下游炎癥因子的高表達，myd88依賴的炎癥通路是TLRs激活后引起炎癥反應的重要通路〔6〕，而其下游通過p38MAPK影響炎癥因子的表達〔9〕。本實驗結果與之前研究認為肥胖小鼠脂肪組織IL-6和TNF-α高表達結果一致〔10〕，炎癥因子的表達可使組織處于氧化應激狀態〔7，11〕。所以我們猜想肥胖小鼠可以通過myd88依賴的p38MAPK途徑激活下游的炎癥因子并使脂肪組織處于氧化應激狀態，ROS是誘導體內發生氧化應激的主要物質〔12〕，能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，并因此形成脂質過氧化物，如MDA，SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，可清除超氧產物，可作為機體還原能力水平的檢測指標。本實驗結果表明高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織處于氧化應激狀態。由于肥胖小鼠脂肪組織TLR2高表達，我們猜想脂肪組織發生的炎癥反應及氧化應激狀態可能與TLR2激活有關，所以我們采用TLR2基因敲除小鼠并給予高脂飲食以探究TLR2基因敲除對高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織炎癥因子的表達和氧化應激狀態的影響。結果顯示TLR2基因敲除抑制了myd88，p38MAPK，IL-6 mRNA和TNF-α mRNA的高表達，并減輕了脂肪組織的氧化應激狀態，綜上所述，TLR2基因敲除可能通過myd88依賴的p38MAPK途徑減輕了高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織的氧化應激狀態，但是這一結論需要進一步利用雙基因甚至多基因敲除動物模型做進一步驗證。