早期肺癌患者細胞活性氧變化水平與免疫功能的相關(guān)性

佐熱古麗·熱依木 吐爾遜·買買提 貝力克孜·麥麥提 姚愛榮

(1阿克蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系,新疆 阿克蘇 843100；2阿克蘇地區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗中心)

據(jù)統(tǒng)計，目前中國男性肺癌的發(fā)病率為5.09萬人/年，中國女性肺癌的發(fā)病率也達2.24萬人/年〔1〕。活性氧(ROS)是機體氧化應(yīng)激反應(yīng)時產(chǎn)生的，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。在免疫功能調(diào)節(jié)中，細胞質(zhì)膜上的還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶同源物(NOX)2參與細胞反應(yīng)生成ROS，其存在影響淋巴細胞的生成與成熟〔2,3〕。本研究主要分析ROS與免疫功能的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2016年6月至2017年12月阿克蘇地區(qū)第一人民醫(yī)院收治的肺癌患者87例為肺癌組，年齡52～73歲，平均62.61歲，男52例，女35例；按ROS水平不同分為3組，ROS<35.0為C組，35.0

1.2主要儀器及試劑 RPMI1640培養(yǎng)基(購自美國sigIlla公司)，胎牛血清(購自美國Gibco公司)，肺泡細胞(購自中國科學(xué)院上海細胞庫)，2'-7'-二氧二氫熒光素二乙酸酯(H2DCFDA)染液(購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(購自上海科華生物技術(shù)有限公司)，ROS水平檢測試劑盒(購自上海翊圣生物科技有限公司)，流式細胞儀〔購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司〕。

1.3細胞分離和培養(yǎng) 取術(shù)中切除的肺癌組織，立即浸泡于無菌的Hank液中，脈沖式反復(fù)沖洗多次后，用組織剪剪成1.0～1.5 mm3碎塊狀，加入0.25%胰蛋白酶溶液和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液，量約為碎塊組織混合液的10倍，在37℃溫度下消化30 min，每5 min搖動1次，將消化液除去，以不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液多次沖洗剩余組織，然后加入適量培養(yǎng)液，以巴氏管反復(fù)吹打組織液至單細胞狀態(tài)〔4,5〕。在細胞中加入RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，搖晃均勻后，在1 000 r/min下離心10 min，將上清液倒掉，加入5 ml細胞培養(yǎng)液懸浮細胞后，接種到細胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞密度>90%時，棄去細胞培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶消化細胞，在1 000 r/min下，離心10 min，用適量RPMI1640完全培養(yǎng)基懸浮細胞后，按照不同比例接種到細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)〔4,6〕，同法進行正常肺泡細胞培養(yǎng)。

1.4ROS水平測定 將培養(yǎng)的肺癌細胞以每孔4×103個細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板上，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄去上清液，將H2DCFDA染液(5 μmol/L)按每孔100 μl加入，避光條件下反應(yīng)30 min后，利用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞熒光強度，激發(fā)波長和吸收波長分別為380 nm和532 nm，熒光強度即代表ROS水平〔7,8〕，同法測定正常肺泡細胞中ROS水平。

1.5免疫功能測定 術(shù)前采集患者空腹靜脈血5 ml，采用流式細胞儀檢測T 淋巴細胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、自然殺傷(NK)細胞百分比〔5,9〕；用ELISA測定空腹靜脈血中可溶性白細胞介素-2受體(sIL-2R)水平〔10〕。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行配對t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組ROS水平比較 肺癌組ROS水平與對照組比較明顯升高(P<0.05)。

2.2兩組免疫功能水平比較 肺癌組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK細胞百分比、sIL-2R與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3肺癌患者細胞中ROS水平與免疫功能相關(guān)性比較 A、C組免疫功能水平除CD4+/CD8+顯著高于B組，其余指標均顯著低于B組，A、B、C三組免疫功能水平除CD4+/CD8+顯著低于對照組外，其余指標均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 肺癌患者細胞中ROS及T淋巴細胞水平測定

與對照組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05

3 討 論

肺癌是惡性腫瘤中治療效果相對較差的一種癌癥，5%的肺癌病患在初診時即已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，而外科手術(shù)治療無疑是現(xiàn)在最直接有效的治療方法，目前多種微創(chuàng)外科治療方法在肺癌的治療中發(fā)揮了強大優(yōu)勢，結(jié)合后續(xù)放療和化療等治療手段，臨床療效正在逐步提高。但肺癌患者機體免疫力往往很差，這在客觀上限制了上述治療方法的應(yīng)用。相關(guān)文獻報道提示ROS是影響人體衰老、染色體畸變、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生及進展的重要分子物質(zhì)〔11～14〕，隨著對ROS研究的深入，對其認識也更加全面，ROS參與多種途徑的信息傳遞過程，參與多種生物學(xué)效應(yīng)，在氧化還原敏感性基因調(diào)節(jié)等過程中起重要作用〔15,16〕。本研究在通過對相關(guān)文獻報道整理總結(jié)的基礎(chǔ)上，提出了對早期肺癌患者癌細胞中ROS水平與機體免疫力的相關(guān)性研究，旨在探索兩者相關(guān)性，為進一步研究提高免疫力和腫瘤治療尋找可靠依據(jù)。

ROS的雙向生物學(xué)效應(yīng)吸引了眾多研究者對其特性、作用過程、影響因素等進行深入研究。ROS在細胞線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞鏈過程中產(chǎn)生，在有氧呼吸過程中，真核細胞中多數(shù)可產(chǎn)生不同濃度的ROS作用于信號傳遞。ROS最先發(fā)現(xiàn)于吞噬細胞，隨著相關(guān)檢測技術(shù)的發(fā)展，陸續(xù)在T、B淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)ROS，尤其是在T淋巴細胞受體活化后的極短時間內(nèi)其細胞內(nèi)即可檢測到ROS生成，說明ROS是T淋巴細胞受體活化過程中的重要作用分子之一〔17〕。研究數(shù)據(jù)顯示，淋巴細胞主要通過細胞膜上NOX2作用生成，而實驗動物體內(nèi)后者功能缺失的T淋巴細胞中ROS的生成量顯著減少且對慢性肉芽腫性病(CGD)易感，這說明機體免疫系統(tǒng)中ROS 的主要來源于NOX2〔18〕。

ROS在機體遭遇病原體侵入后可大量產(chǎn)生，成為機體防御病原體的武器，目前其產(chǎn)生的超氧化物對于病原體的防御殺傷能力還未有明確定論〔2〕，但超氧化物可進行后續(xù)反應(yīng)生成相對穩(wěn)定的過氧化氫(H2O2)，而H2O2可反應(yīng)達到殺傷病原體的目的〔2〕。ROS可提高NK細胞的活性且介導(dǎo)NK細胞的病原體溶解作用。Case等〔19〕在ROS影響胸腺T細胞發(fā)育成熟的實驗中，提高胸腺組織中ROS濃度后T細胞發(fā)育明顯受到抑制且影響獲得性免疫功能的成熟。

對于肺癌患者，提高免疫力治療是整個治療方案和過程中極為重要的一項治療措施，但由于癌細胞轉(zhuǎn)移、肺功能下降等因素制約，許多肺癌患者免疫力十分低下，后續(xù)治療效果欠佳。ROS對機體具有雙重效應(yīng)，是一把雙刃劍，我們可通過對肺癌細胞中ROS水平的測定與機體免疫功能水平相對比，進一步把握兩者之間的相關(guān)性，為制定肺癌患者治療方案提供參考。本研究中數(shù)據(jù)分析顯示，肺癌患者癌細胞內(nèi)ROS水平較正常肺泡細胞明顯增高，提示ROS在肺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。機體免疫功能水平與肺癌細胞中ROS濃度水平具有明顯依賴性，ROS低濃度的增高有助于機體免疫功能提高，高濃度的增高使得機體免疫功能下降，相關(guān)性呈現(xiàn)波峰狀態(tài)。

隨著現(xiàn)代檢測技術(shù)的發(fā)展，對ROS的研究也越來越深化和多元，ROS在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的具體作用機制正在被一步步剖析，在對機體免疫力調(diào)節(jié)方面的作用也日益凸顯，本研究通過闡述肺癌細胞中ROS水平與免疫功能強弱之間的關(guān)系，為早期肺癌患者提高免疫力和腫瘤治療尋找最佳契機。我們可以通過調(diào)控肺癌細胞中ROS水平至適當(dāng)濃度，使機體具有最佳免疫功能，結(jié)合提高免疫力藥物治療，為腫瘤治療方案的施行創(chuàng)造機會。后期，我們將繼續(xù)探索免疫功能最佳的肺癌細胞中ROS濃度靶點，為臨床研究提供依據(jù)，為肺癌的治療營造更好的機體條件。