轉(zhuǎn)錄因子FHL2在肝細胞癌中的表達研究

原發(fā)性肝癌（PHC）是臨床常見的惡性腫瘤，主要包括肝細胞癌、肝內(nèi)膽管細胞癌和肝細胞癌-肝內(nèi)膽管細胞癌混合型等不同病理類型，其中肝細胞癌（HCC）占90%以上。我國的肝癌發(fā)病率占全世界肝癌的55%，而我國死于肝癌的人數(shù)占全世界死于該疾病的45%[1]。PHC具有起病隱匿、癥狀不明顯、進展迅速等特點，很多PHC患者因得到確診治療時已經(jīng)達到局部晚期或已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，從而失去了外科手術(shù)治療的最佳時機。目前化療藥物的副作用比較大，對器官和細胞的選擇性較小，殺死腫瘤細胞的同時對正常細胞也有極大傷害，治療并不能取得很好的臨床療效，致使肝癌患者有較高的復(fù)發(fā)率，較易發(fā)生轉(zhuǎn)移。我們通過分析32例肝細胞癌患者病情，利用免疫組化技術(shù)及RT-PCR技術(shù)檢測FHL2在肝細胞癌中的表達情況。初步探討FHL2在肝細胞癌中可能發(fā)揮的作用，觀察其對肝細胞癌生物學(xué)行為的影響，分析FHL2與肝細胞癌的相關(guān)性及其作用機制，為了探索肝癌基因治療合適的靶位，我們對轉(zhuǎn)錄因子FHL2在肝癌中的表達情況進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇我院32例肝細胞癌患者，手術(shù)前均未接受放療和化療，送檢時間為2011年1月～2013年12月。其中男18例，女14例；年齡45～79歲，平均（54.6±3.6）歲。依原發(fā)性肝癌的TNM分期（2010年UICC/AJCC國際分期）和腫瘤直徑是否大于5cm將32例患者分為兩組，分別為A組（Ⅰ期+Ⅱ期），腫瘤直徑≤5cm，B組（Ⅲ期+Ⅳ期），腫瘤直徑＞5cm，每組16例。兩組患者分別按性別、年齡、是否感染乙型肝炎病毒三項指標(biāo)進行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），有可比性。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較[n（%）]

1.2 實驗試劑RNAiso Reagent購自Takara公司，胰蛋白酶購自Merk公司，Trizol總RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒購自北京Invitrogen公司，SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，EDTA、DAB購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，全自動免疫組化儀配套試劑、全自動免疫組化儀二抗、全自動免疫組化儀購自羅氏公司，F(xiàn)HL2鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 組織處理 ①取組織塊剪碎后加入胰酶，通過離心后收集肝癌細胞置于培養(yǎng)瓶中；②吸棄培養(yǎng)基后在收集的肝癌細胞中加入RNAiso Reagent，吸取含肝癌細胞的裂解液至離心管中，隨后在室溫下靜置 5min。4℃條件下 12 000r/min 離心 15min；③吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一支新的離心管中，向上清液中加入等體積（1/5體積的RNAiso Reagent）的異丙醇，充分混勻后室溫下靜置10min；④在4℃條件下12 000r/min離心10min，離心后觀察試管底部，可見沉淀。向沉淀中加入75%的乙醇1ml，然后4℃條件下12 000r/min離心5min，并盡量徹底地棄去乙醇。室溫條件下干燥沉淀5min，然后加入適量的RNasefree水并充分溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后置于-80℃冰箱保存。

1.3.2 RNA濃度測定 ①將核酸蛋白分析儀打開，調(diào)整屏顯稀釋倍數(shù)為50，預(yù)熱30min；②用三蒸水清洗比色杯3次，并用三蒸水調(diào)零；③向比色杯中加入98μl雙蒸水，接著加入2μl待測樣本，輕輕混勻后放入核酸蛋白分析儀中。共讀數(shù)3次，然后取平均值。

1.3.3 免疫組化 ①石蠟切片厚度為3～5μm；②在60℃恒溫烤箱中烘烤60min；③二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中依次脫蠟，每缸5min；④依次無水乙醇Ⅰ1min、無水乙醇Ⅱ 30s、95% 乙醇 30s、85% 乙醇 30s、75%乙醇30s脫去二甲苯至蒸餾水沖洗；⑤0.01M（pH 7.2）磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 3次，每次 5min；⑥室溫下3%雙氧水阻斷10min，PBS洗滌3次，每次5min；⑦抗原修復(fù)：加入EDTA緩沖液放置于微波爐中在10檔3min，高壓鍋沸水浴7min，溫水孵育30min，自然冷卻后PBS洗滌3次，每次5min；⑧棄多余的液體，10%山羊血清封閉，放置30min；⑨棄去多余血清，滴加一抗后，置于4℃冰箱中過夜；⑩37℃復(fù)溫半小時，PBS洗滌3次，每次5min；滴加二抗，在室溫下孵育30min，PBS洗滌3次，每次5min；DAB顯色：加入充分混勻新鮮配制的DAB溶液，使其顯色3～10min；PBS反復(fù)洗滌3次，每次5min；放入蘇木素中復(fù)染細胞核1min，用自來水充分沖洗后，投入鹽酸-乙醇分化液中分化胞漿3s，藍化；依次投入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ脫水后，投入二甲苯透明，使用中性樹膠封固。

1.4 結(jié)果分析抗體免疫組化定位后，通過光學(xué)顯微鏡觀察，并拍照記錄。所有照片均使用同一光學(xué)顯微鏡（BX51型，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)）在相同條件下拍攝，因此消除了實驗誤差。拍攝過程中要保持穩(wěn)定的顯微鏡光源亮度，在固定的曝光時間內(nèi)拍照，其中曝光度選擇在最高亮度值230附近。對于抗體表達陽性的區(qū)域，即照片顯示有黃色或棕黃色的區(qū)域累積光密度（IOD SUM）及目標(biāo)區(qū)域面積使用 Image-pro plus6.0（IPP6.0）軟件測定，每一例經(jīng)免疫組化定位的病理切片選擇5個400×視野進行拍照并認真分析，之后由IPP導(dǎo)入Excel表格，并依此計算平均光密度值（mean density），計算公式為平均光密度=IOD SUM/目標(biāo)區(qū)域面積，最后將每個病例5個400×視野的平均光密度值的均值作為免疫組化的分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。組織標(biāo)本FHL2 mRNA表達水平的實時熒光PCR結(jié)果進行Mann-Whitney U檢驗，所有的檢測均選擇雙尾檢驗且通過 SigmaStat 3.1 軟件（Systat Software，Inc，Richmond，CA）實現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 FHL2表達與肝癌進展分期的相關(guān)性

2.1.1 RT-PCR結(jié)果 患者肝癌組織中FHL2有少量表達，A組和B組肝癌組織中FHL2的mRNA相對表達量顯著高于對應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組患者肝癌及癌旁組織FHL2 mRNA相對表達量（±s）

表2 兩組患者肝癌及癌旁組織FHL2 mRNA相對表達量（±s）

注：P為分別與癌旁組織比較

分組 n FHL2 mRNA 相對表達量 P A組 161.56±0.0740.048 B組 161.38±0.0430.025癌旁組織 320.43±0.065

2.1.2 免疫組化結(jié)果 患者肝癌組織中有FHL2的表達，并且胞漿及胞核中均有表達，A組患者肝癌組織FHL2的表達高于B組，癌旁組織中幾乎沒有表達。見表3、圖1。

表3 兩組患者肝癌及癌旁組織FHL2表達平均光密度值

圖1 肝癌及癌旁組織中FHL2免疫組化結(jié)果（400×）

2.2 FHL2表達與肝癌臨床療效相關(guān)性免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)HL2在經(jīng)手術(shù)及化療后緩解或未緩解患者的肝癌細胞核及胞漿中均有表達，病情緩解患者肝癌細胞中FHL2的表達高于經(jīng)治療病情穩(wěn)定或進展患者。見圖2、表4。

圖2 兩組患者肝癌組織中FHL2免疫組化結(jié)果（400×）

表4 不同預(yù)后患者肝癌及癌旁組織表達FHL2平均光密度值（±s）

表4 不同預(yù)后患者肝癌及癌旁組織表達FHL2平均光密度值（±s）

預(yù)后 n FHL2平均光密度值 P病情緩解患者 160.42±0.0230.00病情穩(wěn)定或進展患者 160.27±0.042

2.3 FHL2表達與肝癌患者是否感染肝炎病毒相關(guān)性RT-PCR結(jié)果顯示，患者肝癌組織中有少量的FHL2表達，A組患者肝癌組織FHL2的表達高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；兩組組內(nèi)感染乙型肝炎病毒與未感染病毒患者肝癌組織中FHL2的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表5。

表5 兩組感染與未感染乙型肝炎病毒患者肝癌組織中FHL2的mRNA相對表達量

3 討論

原發(fā)性肝癌常見組織病理學(xué)類型包括肝細胞癌（hepatic celluler cancer，HCC）、肝內(nèi)膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和肝細胞癌 -肝內(nèi)膽管細胞癌混合型，其中HCC占90%以上，多數(shù)患者確診時已是晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，失去外科手術(shù)治療的機會。因此，人們對新的治療方法如基因治療、免疫治療、靶向腫瘤干細胞治療等生物治療手段的關(guān)注越來越多[2]。

轉(zhuǎn)錄因子FHL2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均有非常重要的作用。FHL2是LIM蛋白家族LIM-only亞類中的成員，LIM蛋白是有一個或多個LIM結(jié)構(gòu)域且可參與調(diào)節(jié)蛋白與蛋白之間相互作用的蛋白質(zhì)[3]。FHL2蛋白在不同組織的細胞分化及惡性腫瘤的發(fā)生方面發(fā)揮著重要作用，鑒于不同的腫瘤細胞類型，轉(zhuǎn)錄因子FHL2發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子的作用，能促進或抑制腫瘤的生長[4，5]。與正常肝組織相比，肝母細胞瘤中FHL2 mRNA有較高水平的表達，β-catenin是該瘤常見的突變體，與FHL2一樣，是共活化物β-catenin/TCF/LEF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，參與肝母細胞瘤的形成，β-catenin有增強轉(zhuǎn)錄的功能[6～8]。研究發(fā)現(xiàn)，過量表達FHL2基因的多種細胞株中其均能誘導(dǎo)細胞凋亡[9～11]。FHL2蛋白在FHL家族中研究最為深入，以體外實驗為主，并且發(fā)現(xiàn)FHL2蛋白能與50多種蛋白相互作用[12]，通過有選擇地使用LIM結(jié)構(gòu)域的不同區(qū)域，參與不同細胞的信號通路而發(fā)揮其生物學(xué)功能。FHL2已被證實參與多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展[13]。實驗表明FHL2在許多組織的細胞分化及癌癥發(fā)生方面有重要作用，它能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子的功能，是雄激素受體（androgen receptor，AR）、激活蛋白 l（activatorprotein 1，AP-1）、cAMP 響應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP responsive element binding protein，CREB）及胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth factorbinding protein 5，IGFBP-5）等多種轉(zhuǎn)錄因子的共調(diào)節(jié)因子；它參與調(diào)控器官的發(fā)育、細胞的分化、染色質(zhì)的重建、細胞凋亡以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[14]。研究表明，F(xiàn)HL2基因表達可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的分化，抑制其生長[15]。

本研究采用免疫組化法及RT-PCR法檢測不同臨床分期患者肝癌組織的FHL2表達情況，比較不同臨床分期患者FHL2表達的差異。肝癌及癌旁組織RT-PCR結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌組織FHL2的表達高于臨床分期為Ⅲ期和Ⅳ期患者，癌旁組織表達量很低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)HL2在胞核及胞漿中均有表達。臨床分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌組織FHL2的表達高于臨床分期為Ⅲ期和Ⅳ期患者，癌旁組織基本沒有表達。經(jīng)平均光密度值檢測，結(jié)果顯示臨床分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌組織表達FHL2確實高于臨床分期為Ⅲ期和Ⅳ期的患者，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。癌旁組織內(nèi)FHL2的表達很低，與腫瘤組織表達FHL2比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。有研究表明，F(xiàn)HL2在肝癌組織中的表達明顯下調(diào)，其抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[16]。根據(jù)本研究免疫組化及RT-PCR結(jié)果，F(xiàn)HL2在肝癌臨床分型為Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌組織中表達高于臨床分期為Ⅲ期和Ⅳ期的患者，提示FHL2在肝癌中主要起抑制作用，在Ⅲ期和Ⅳ期患者中低表達，Ⅲ期和Ⅳ期患者的肝癌病情進展更快。

免疫組化顯微鏡下觀察顯示經(jīng)手術(shù)及化療治療緩解患者肝癌組織FHL2表達高于治療后病情穩(wěn)定或進展患者。經(jīng)平均光密度值檢測，結(jié)果顯示治療緩解患者肝癌組織FHL2表達高于治療后病情穩(wěn)定或進展患者，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。FHL2在肝癌組織中起抑制作用，治療緩解患者肝癌組織FHL2表達高于治療后病情穩(wěn)定或進展患者，說明緩解患者高表達的FHL2能夠抑制肝癌的進一步發(fā)展，因此治療后療效更好。在肝癌的基因治療中，可以考慮促進FHL2的表達以抑制肝癌病情的發(fā)展，也可以將肝癌組織中FHL2的表達量作為預(yù)測肝癌療效的指標(biāo)。

RT-PCR結(jié)果顯示，Ⅰ期和Ⅱ期感染與未感染乙型肝炎病毒患者FHL2表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），Ⅲ期和Ⅳ期感染與未感染乙型肝炎病毒患者FHL2表達差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），感染乙型肝炎病毒的Ⅰ期和Ⅱ期肝癌患者FHL2表達高于Ⅲ期和Ⅳ期患者（P<0.05）。說明是否感染乙型肝炎病毒對肝癌組織表達FHL2并無影響。因此，轉(zhuǎn)錄因子FHL2在肝細胞癌組織中的表達與進展分期及臨床療效有明顯的相關(guān)性，可以作為肝細胞癌分期的輔助診斷標(biāo)準及預(yù)測臨床療效的指標(biāo)，并且可以作為肝癌基因治療的新靶點，值得臨床推廣應(yīng)用。