N-乙酰轉(zhuǎn)移酶8在人腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

腎癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，起源于腎實(shí)質(zhì)小管上皮系統(tǒng)，約占人類全部惡性腫瘤的2%～3%，通常又被稱為腎細(xì)胞癌[1，2]。RCC約占腎臟腫瘤的90%，其病理類型有多種，其中80%為腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，CCRCC）[3]。RCC 的發(fā)生發(fā)展是多步驟、多基因共同作用的過程，其發(fā)病風(fēng)險與個體對內(nèi)、外源性有害物質(zhì)代謝解毒活性的遺傳變異有關(guān)，人體攝入大多數(shù)外源性致癌物后，需經(jīng)過體內(nèi)代謝激活才能損傷DNA，引起基因突變從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變[4]。N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（N acetyltransferases，NAT）是人體內(nèi)重要的致癌物滅活酶，其中NAT8（N-乙酰轉(zhuǎn)移酶8）是蛋白質(zhì)編碼基因，為NAT家族重要成員之一，作為一種微粒體酶，僅在人的腎臟和肝臟中表達(dá)，被認(rèn)為在腎臟和肝臟結(jié)構(gòu)及功能的發(fā)育和維持中發(fā)揮重要作用[5]。NAT8可以乙酰化半胱氨酸S-綴合物的游離α-氨基形成硫酸，還可以通過乙酰化和調(diào)節(jié)PROM1的表達(dá)來調(diào)節(jié)凋亡[6，7]。2011年1月～2014年12月和 2016年9月～2017年2月我們分別檢測42例CCRCC患者腫瘤及瘤旁組織中NAT8蛋白的含量以及12例CCRCC患者新鮮腫瘤組織及癌旁組織中NAT8 mRNA含量，分析NAT8與CCRCC病理分期、腫瘤分級以及患者臨床特征的關(guān)系，探討NAT8與CCRCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 qRT-PCR實(shí)驗組 12例患者術(shù)后病理均證實(shí)為CCRCC。5例行腎癌根治術(shù)，7例行保留腎單位腎腫瘤切除術(shù)；男7例，女5例；右腎腫瘤8例，左腎腫瘤 4例；年齡 18～80歲，平均（55.3±9.5）歲；腫瘤直徑大小 1.0～10.0cm，平均（5.0±2.1）cm；高分化1例，中分化10例，低分化1例；T1期11例，T2期1例。

1.1.2 免疫組化實(shí)驗組 42例患者術(shù)后病理均證實(shí)為CCRCC。42例均行腎癌根治術(shù)；男22例，女20例；年齡18～80歲，平均（53.7±10.4）歲，其中≤54歲者22例，＞54歲者20例；腫瘤直徑大小2.0～10.0cm，平均（5.8±1.9）cm，其中≤7cm 31例，＞7cm 11例；TNM 分期：Ⅰ期31例，Ⅱ期11例，無Ⅲ及Ⅳ期患者；參照Fuhrman分級[1]：高分化25例，中分化17例，無低分化患者。

1.2 試驗方法

1.2.1 qRT-PCR實(shí)驗組 取組織樣本75mg，Trizol法提取RNA，使用微量分光光度計檢測RNA濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Random primer擴(kuò) 增 RNA，NAT8引 物 設(shè) 計 為 F：5'-CAAGCCCCAGACGGTATCTC-3'；R：5'-TCCT GGTATTTGCGGATGTGA-3'，產(chǎn)物長度 190bp。內(nèi)參β-actin（Human）引物設(shè)計為F：5'-AGCACAGAG CCTCGCCTTTG-3'，R：5'-CTTCTGACCCATG CCCACCA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度208bp。熒光PCR擴(kuò)增，依次按照 95℃ 10s、60℃ 60s、95℃ 15s順序，并從60℃緩慢加熱到99℃（+0.05℃/s，期間收集熒光），以此建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線。各樣品的目的基因和內(nèi)參基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，采用ΔΔCт的相對定量：儀器直接生成各樣品目的基因和內(nèi)參基因的Cт值。將每個樣品的目的基因濃度除以其內(nèi)參基因的濃度，所得出的數(shù)值即為此樣品此基因校正后相對含量。

1.2.2 免疫組化實(shí)驗組 免疫組化染色法測定42例CCRCC腫瘤及瘤旁組織標(biāo)本NAT8蛋白，收集腫瘤及癌旁組織（癌旁組織為距離腫瘤1cm以上的腎組織），手術(shù)切除標(biāo)本后立即置入40%甲醛溶液中固定48～72h。參照MaxVisionTM/HRP即用型試劑盒操作說明書進(jìn)行免疫組化染色，包括脫蠟、水化，抗原修復(fù)，加一抗（兔抗人 NAT8多克隆抗體，購自Abcam公司），加二抗（即用型MaxVisionTM /HRP免疫組化試劑盒，購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），顯色，復(fù)染，脫水、封片。采用免疫組織化學(xué)Volm判斷標(biāo)準(zhǔn)，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為陽性（++），5～6分為強(qiáng)陽性（+++）。陰性和弱陽性視為低表達(dá)狀態(tài)，陽性和強(qiáng)陽性視為高表達(dá)狀態(tài)。所有標(biāo)本的IHC切片交由兩位病理專家獨(dú)自審閱，分別給出各自結(jié)論，當(dāng)兩位專家意見無法統(tǒng)一時，再請第三位病理學(xué)專家獨(dú)立給予判別。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以例比較，采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR實(shí)驗組12例CCRCC患者新鮮腫瘤組織及癌旁組織行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示CCRCC組織中NAT8 mRNA的相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常腎組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測CCRCC與癌旁組織NAT8mRNA表達(dá)水平

2.2 免疫組化實(shí)驗組IHC染色結(jié)果顯示，42例患者腫瘤及癌旁正常組織標(biāo)本中NAT8均有不同程度的表達(dá)（見圖2），NAT8蛋白在腎癌中呈低表達(dá)，癌旁正常腎組織中高表達(dá)，腎癌及癌旁組織中低表達(dá)率分別為 60%（25/42）、12%（5/42），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.741，P<0.001）。

圖2 免疫組化檢測CCRCC組織中NAT8表達(dá)水平

42例CCRCC患者中，不同年齡、性別患者癌組織中NAT8表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.952、P=0.187）；不同腫瘤直徑、腫瘤分期及分級患者癌組織中NAT8表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

42例CCRCC患者中，隨訪25例，失訪17例。隨訪12個月結(jié)果：無死亡患者，1例帶瘤生存，為低表達(dá)；24例無瘤生存，分別為9例高表達(dá)、15例低表達(dá)；隨訪24個月結(jié)果：1例死亡，為低表達(dá)；6例帶瘤生存，2例為高表達(dá)，4例低表達(dá)；18例無瘤生存，分別為7例高表達(dá)、11例低表達(dá)；隨訪36個月結(jié)果：2例死亡，均為低表達(dá)，8例帶瘤生存，3例為高表達(dá)，5例為低表達(dá)；15例無瘤生存，分別為6例高表達(dá)、9例低表達(dá)。死亡患者均為腫瘤組織NAT8低表達(dá)患者，腫瘤組織NAT8高表達(dá)CCRCC患者隨訪3年無一例死亡。

表1 NAT8表達(dá)與CCRCC患者臨床特征的關(guān)系[n（%）]

3 討論

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類生命健康。據(jù)統(tǒng)計，美國2016年新診斷腎癌患者62 700例，因腎癌死亡者 14 020例，診斷時中位年齡為64歲[8]。我國腎癌的發(fā)病年齡亦漸趨于年輕，發(fā)病率呈逐年增長趨勢，每年確診為腎癌患者的比例約為男性37/10萬人群、女性16/10萬人群。常見惡性腫瘤中，近20年來腎癌的發(fā)病率上升速度最快[9]，由于RCC臨床癥狀多變，目前對其早期診斷較為困難，尚無特異性方法，約1/4～1/3的患者入院診斷時已為中晚期；同時，由于腎癌對放射治療及化學(xué)治療均不敏感，根治性手術(shù)切除為早期腎癌患者的主要治療方式，然而術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然可能高達(dá)20%[10]。因此，臨床上對不同腎癌患者預(yù)后的合理預(yù)測將有助于改善其治療效果。

目前，腎癌的組織學(xué)類型主要有10個，包括透明腎細(xì)胞癌、多房囊性透明腎細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌Ⅰ型和Ⅱ型、嫌色腎細(xì)胞癌、Bellini集合管癌、腎髓樣癌、Xp11易位性腎癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤伴發(fā)癌、黏液性管狀及梭形細(xì)胞癌及尚未分類的腎細(xì)胞癌[3]。其中最常見的組織學(xué)類型是透明腎細(xì)胞癌，占腎癌總數(shù)的70%～90%[11]。手術(shù)為早期CCRCC有效的治療方法，然而術(shù)后一旦發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。目前臨床上將癌腫的直徑大小、組織學(xué)類型、Fuhrman分級、腫瘤分期、腫瘤壞死、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及微血管浸潤等用來預(yù)測腎癌術(shù)后的預(yù)后情況，然而臨床報道差異較大，且尚無理想的單一臨床因素可以預(yù)測腎癌患者的預(yù)后。

近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的蛋白標(biāo)記物與CCRCC發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。它們的發(fā)現(xiàn)不僅有助于評估CCRCC患者的預(yù)后，同時也有助于臨床醫(yī)生明確 RCC患者的診斷、預(yù)判其術(shù)后局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并可能成為新的靶點(diǎn)，用于分子靶向藥物的研發(fā)及CCRCC患者的治療[12]。NAT8為N-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，其功能是催化乙酰基團(tuán)從乙酰輔酶A（CoA）到芳香胺和酰腙等雜環(huán)胺類物質(zhì)，在某些藥物代謝、致癌物質(zhì)滅活或活化過程中都起著重要的作用。NAT8在正常的肝及腎組織中高表達(dá)[13]。Zand等[14]研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中NAT8及其代謝產(chǎn)物N-乙酰天冬氨酸（NAA）表達(dá)水平與患者總體生存期具有相關(guān)性，且靶向干擾NAT8可下調(diào)FOXM1、降低腫瘤細(xì)胞活力。Lou等[15]在非小細(xì)胞型肺癌（NSCLC）中發(fā)現(xiàn)，通過siRNA下調(diào)NAT8可抑制NSCLC細(xì)胞的NAA產(chǎn)生，提示NAT8在非小細(xì)胞肺癌中的作用可能與其代謝物NAA密切相關(guān)。然而，目前NAT8在腎癌方面的研究報道較少。在本研究中，我們檢測了NAT8在CCRCC組織及癌旁正常腎組織中的表達(dá)。采用免疫組化法檢測42例CCRCC腫瘤組織及癌旁正常腎組織中NAT8的表達(dá)，結(jié)果顯示在正常腎組織及CCRCC組織中均可見陽性表達(dá)。然而，在正常腎組織中，NAT8以高表達(dá)為主，而CCRCC組織中NAT8以低表達(dá)為主。我們進(jìn)一步采用實(shí)時定量PCR技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAT8在CCRCC中的表達(dá)水平明顯低于其配對的癌旁正常腎組織（P=0.003）。該結(jié)果表明NAT8的低表達(dá)可能與CCRCC相關(guān)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NAT8表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分級及TNM分期相關(guān)，其中，腫瘤直徑≥7cm患者中NAT8低表達(dá)患者比例明顯高于腫瘤直徑＜7cm的腫瘤患者，中等分化患者中NAT8低表達(dá)患者比例高于高分化患者。Ⅱ期患者中NAT8低表達(dá)患者比例明顯高于I期患者。因此，我們認(rèn)為NAT8低表達(dá)與CCRCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。另外，本研究隨訪過程中有2例患者死亡，均為腫瘤組織NAT8低表達(dá)患者，但應(yīng)考慮腫瘤分期分級的影響及樣本量較少、隨訪時間短等因素。

總之，本研究表明NAT8在CCRCC中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與CCRCC的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)。檢測NAT8表達(dá)量有望為CCRCC患者個體化治療及隨訪提供依據(jù)，改善CCRCC患者預(yù)后。然而，因樣本量少、隨訪時間短、失訪率高等因素，NAT8低表達(dá)與CCRCC進(jìn)展的相關(guān)性以及與患者預(yù)后的相關(guān)性尚有待后續(xù)在細(xì)胞水平、動物模型水平進(jìn)一步行功能及機(jī)制的相關(guān)研究。