基于線粒體凋亡信號(hào)通路的二甲雙胍抗骨肉瘤體內(nèi)外作用機(jī)制研究*

王延國(guó) 宮慶娜 楊延霞 王 軍 周忠水

山東省濱州市中心醫(yī)院 1 骨外科 2 麻醉科，山東省惠民縣 251700

骨肉瘤(Osteosarcoma),又稱成骨肉瘤,是臨床常見原發(fā)惡性骨腫瘤，占原發(fā)性惡性骨腫瘤首位(40.51%)，18歲以下的青少年為好發(fā)人群,嚴(yán)重影響青少年的身體健康[1-2]。二甲雙胍作為一種經(jīng)典的降糖藥物，其抗腫瘤作用近年來受到廣泛重視[3-4]。本研究項(xiàng)目以人骨肉瘤裸鼠模型及細(xì)胞株U2OS、143B細(xì)胞為研究對(duì)象，分析二甲雙胍在體內(nèi)和體外對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響并初步探討其分子機(jī)制，為其作為抗骨肉瘤藥物研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤U2OS、143B細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院北京生命科學(xué)院細(xì)胞所。細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清、雙抗及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司。二甲雙胍、MTT、Hoechst33342購(gòu)自上海碧云天生物公司。PI單染試劑盒購(gòu)自南京凱基生物。細(xì)胞培養(yǎng)CO2孵箱為賽默飛世爾(Thermo Fisher公司)儀器。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀為Moflo XDP貝克曼庫(kù)爾特(Beckman Coulter公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含雙抗及10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，細(xì)胞孵育條件為37℃，5%CO2的濕潤(rùn)無菌環(huán)境，每2d更換新的培養(yǎng)基。

1.3 二甲雙胍對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響(MTT法) 骨肉瘤細(xì)胞株細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。二甲雙胍分別作用24、48、72h后，每孔加入濃度為5g/L的MTT溶液10μl，再繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加150μl DMSO，避光輕微震蕩5min使結(jié)晶充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光度(A)值，檢測(cè)波長(zhǎng)580nm，以630nm波長(zhǎng)來校正數(shù)值。細(xì)胞存活抑制率=(對(duì)照組吸光度數(shù)值-二甲雙胍組吸光度數(shù)值)/對(duì)照組吸光度×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察(Hoechst33342染色) 把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)繁殖期骨肉瘤細(xì)胞接種于蓋玻片，細(xì)胞貼壁后，每孔放入二甲雙胍；對(duì)照組放入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)。作用48h后，棄去藥物，PBS液漂洗2次，細(xì)胞固定液固定約30min；吸掉固定液，PBS漂洗2次，加入推薦濃度的Hoechst33342暗室避光反應(yīng)25min；顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期時(shí)相 將骨肉瘤細(xì)胞均勻種植于六孔板上，細(xì)胞貼壁后，加入二甲雙胍干預(yù)48h，以無EDTA的胰酶消化骨肉瘤細(xì)胞并分別收集；PBS漂洗2次，離心棄掉上清液；收集大約105/組細(xì)胞加入緩沖液1ml并重懸細(xì)胞；繼而加入5μl Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑及5μl PI試劑，避光反應(yīng)15min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 Western Blot法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞周期凋亡蛋白的影響 收集不同濃度組處理48h后的骨肉瘤細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液制備細(xì)胞總蛋白，嚴(yán)格按Bradford蛋白分析系統(tǒng)按規(guī)定的操作順序檢測(cè)細(xì)胞蛋白濃度，取等量總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜24h，5%脫脂牛奶室溫下封閉60min，然后加入各種一抗4℃過夜，之后再加入相應(yīng)二抗室溫下作用60min，TBST洗滌加入ECL顯影劑，上掃描機(jī)掃描。

1.7 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 40只裸鼠均為雄性，4～6周齡，體重18～20g；右后肢皮下接種腫瘤細(xì)胞，6d以后，挑選腫瘤體積100mm3的小鼠24只，并隨機(jī)分為4組，每組6只，并稱量體重；分組后第1天即開始給予小鼠藥物注射，4組裸鼠分別給予生理鹽水、二甲雙胍200mg/(kg·d)、順鉑10.0mg/(kg·d)及二甲雙胍聯(lián)合順鉑進(jìn)行處理，給藥方式為腹腔注射，每72h給藥1次。

1.8 裸鼠的體質(zhì)量及皮下瘤體積的記錄 小鼠每次給藥時(shí)，觀察有無死亡小鼠及飲食、毛發(fā)、活動(dòng)等一般狀態(tài)，定期測(cè)量并記錄腫瘤的長(zhǎng)徑、短徑并計(jì)算體積，腫瘤體積計(jì)算方法為：V=1/2L×R2(L為長(zhǎng)徑，R為短徑)直至周期結(jié)束。處死小鼠，取出腫瘤稱重記錄，解剖裸鼠，觀察有無腸、肺、肝臟、腦等遠(yuǎn)隔臟器侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生；瘤體部分組織制作石蠟切片，以備免疫組化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Origin7.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以means±SD表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)及其他相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍抑制體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性 MTT法分別測(cè)定人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和143B經(jīng)不同濃度二甲雙胍(0、5.0、10.0、20.0、50.0mM)分別處理24h、48h、72h，觀察以上濃度的二甲雙胍分別聯(lián)合應(yīng)用5μg/ml、10μg/ml順鉑作用于兩種骨肉瘤細(xì)胞48h后細(xì)胞增殖存活率。兩種細(xì)胞系的增殖存活率均隨著二甲雙胍濃度的增加或者處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)(見圖1)，說明二甲雙胍對(duì)體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞具有明顯的存活抑制作用，且這種作用呈現(xiàn)一定的劑量—時(shí)間依賴效應(yīng)。

2.2 二甲雙胍誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 本研究采用Hoechst33342對(duì)經(jīng)10.0mM 二甲雙胍處理48h的U2OS和143B細(xì)胞染色，熒光顯微鏡觀察分析。兩種細(xì)胞的空白對(duì)照組在熒光顯微鏡下呈均勻微弱藍(lán)色熒光，經(jīng)10.0mM二甲雙胍處理48h后的兩種細(xì)胞系均不同程度呈現(xiàn)顯著強(qiáng)于對(duì)照組的藍(lán)色顆粒狀熒光，部分區(qū)域可見代表細(xì)胞凋亡的凋亡小體出現(xiàn)(見圖2)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)二甲雙胍作用48h后的細(xì)胞周期三個(gè)階段中腫瘤細(xì)胞的分布情況，顯示二甲雙胍引起U2OS細(xì)胞阻滯于S期，143B細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期G0/G1期。提示二甲雙胍誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞周期阻滯具有細(xì)胞特異性。Annexin V/PI雙染法，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種U2OS和143B細(xì)胞經(jīng)不同濃度二甲雙胍(0、5.0、10.0、20.0、50.0mM)處理48h后的凋亡率。結(jié)果顯示，不同濃度二甲雙胍處理U2OS和143B細(xì)胞48h，可以引起細(xì)胞凋亡，且凋亡細(xì)胞數(shù)量隨二甲雙胍濃度增加而增加，具有明顯的劑量依賴關(guān)系(見表1)。

2.4 二甲雙胍對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 二甲雙胍處理48h后，內(nèi)部通路(即線粒體介導(dǎo)的凋亡通路)系列信號(hào)分子，如抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2等的表達(dá)量隨二甲雙胍濃度的增加而減少，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量隨二甲雙胍處理濃度的增加而明顯增加，處于凋亡信號(hào)通路下游的PARP則表現(xiàn)出明顯的剪切化激活。還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)這一凋亡發(fā)生的關(guān)鍵事件。

圖1 二甲雙胍對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

圖2 二甲雙胍誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

組別nG0/G1(%)S(%)G2/M(%) 凋亡率(%)對(duì)照組638.6±2.637.7±5.023.7±8.61.10±0.61二甲雙胍組10mmol/L652.4±1.926.6±2.721.0±2.1 17.50±0.8220mmol/L669.7±6.111.8±4.6 18.5±3.3 26.18±4.41

2.5 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 各組小鼠精神狀態(tài)尚可，攝食尚可，反應(yīng)較靈敏，食水量基本正常，順鉑治療組的裸鼠精神稍差，攝食尚可，反應(yīng)不夠靈敏，順鉑聯(lián)合二甲雙胍治療組的小鼠精神狀態(tài)比較差，攝食明顯少于其他治療組，各實(shí)驗(yàn)組間BALB/C小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)及生活表現(xiàn)總體良好，各組沒有出現(xiàn)小鼠死亡(見圖3)。

實(shí)驗(yàn)過程結(jié)束后將所有裸鼠脫臼致死，取出瘤體稱重。研究證實(shí)單用二甲雙胍可以抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的增殖，但與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.08)；有效劑量的二甲雙胍聯(lián)合順鉑可以在裸鼠體內(nèi)抑制人骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，與對(duì)照組或單用順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2、3)。二甲雙胍單用組腫瘤轉(zhuǎn)移灶的大小及數(shù)目無顯著差異。

表2 二甲雙胍治療前、后各組裸鼠的體重

表3 二甲雙胍對(duì)裸鼠皮下瘤的影響

3 討論

骨肉瘤的治療是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界所面臨的重要挑戰(zhàn)之一。由于骨肉瘤本身所具有的生物學(xué)特性，使其成為目前尚缺乏有效治愈手段的疾病之一。作為最經(jīng)典的抗糖尿病藥物之一，二甲雙胍具有多重降糖機(jī)制。近年來，二甲雙胍因其在抗腫瘤研究中巨大潛力而備受關(guān)注[5]。國(guó)內(nèi)外陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道二甲雙胍對(duì)多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，如肺癌[6-7]、大腸癌[8]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[9-10]等。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)等探討二甲雙胍對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系U2OS、143B細(xì)胞增殖活性及對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。建立裸鼠荷腫瘤模型，觀察二甲雙胍對(duì)腫瘤在裸鼠體內(nèi)的抑制作用。研究結(jié)果顯示二甲雙胍可抑制人骨肉瘤U2OS和143B細(xì)胞的增殖活性，且抑制作用具有一定的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。通過熒光顯微鏡觀察二甲雙胍(10mM,48h)處理組的兩種骨肉瘤細(xì)胞系呈現(xiàn)出明顯強(qiáng)于對(duì)照組的顆粒狀藍(lán)色熒光，且能夠找到凋亡小體的影像。Annexin V/PI雙染法顯示不同濃度二甲雙胍處理U2OS和143B細(xì)胞48h能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞骨肉瘤細(xì)胞凋亡。Western Blot方法進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外部通路(即死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路)[11-12]的主要信號(hào)分子Fas和Fas-L的表達(dá)量在二甲雙胍誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和143B的凋亡中并沒有發(fā)生明顯變化；內(nèi)部通路(即線粒體介導(dǎo)的凋亡通路)所涉及的信號(hào)分子，如抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2等的表達(dá)量均隨二甲雙胍處理濃度增加而明顯減少，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量隨二甲雙胍處理濃度增加而明顯增加，處于凋亡信號(hào)通路下游的PARP則表現(xiàn)出明顯的剪切化激活。還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)這一凋亡發(fā)生的關(guān)鍵事件。這些結(jié)果較為詳細(xì)地揭示了二甲雙胍在體外主要是通過內(nèi)部通路(即線粒體介導(dǎo)的凋亡通路)[13-14]途徑來誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制。

圖3二甲雙胍對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)影響的體內(nèi)研究

二甲雙胍體內(nèi)的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)報(bào)道較少，如Xiong等[15]報(bào)道較低劑量的二甲雙胍單用或聯(lián)合應(yīng)用順鉑均能抑制荷肝癌裸鼠腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)。李學(xué)玲等[16]報(bào)道二甲雙胍能夠抑制裸鼠肺腺癌抑制瘤的增殖活性，單用二甲雙胍抑瘤率為5.12%，順鉑組抑瘤率為22.8%，順鉑聯(lián)合應(yīng)用二甲雙胍組抑瘤率為31.0%。目前國(guó)內(nèi)尚未見有關(guān)于二甲雙胍抑制裸鼠荷骨肉瘤抑制瘤生長(zhǎng)增殖的報(bào)道。本組體內(nèi)試驗(yàn)部分發(fā)現(xiàn)有效劑量的二甲雙胍聯(lián)合順鉑可在裸鼠體內(nèi)抑制人骨肉瘤細(xì)胞系143B細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，與對(duì)照組或單用順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

目前二甲雙胍抗腫瘤作用研究主要集中于實(shí)驗(yàn)室研究，所用二甲雙胍濃度顯著高于臨床糖尿病患者所用劑量，患者能否耐受如此大劑量二甲雙胍尚需大量的臨床試驗(yàn)。