急性腦梗死患者血清let-7f、IL-6的水平變化及意義

唐國(guó)富，李志遠(yuǎn)，馬可，呂華東，龐文軍

(1欽州市第一人民醫(yī)院，廣西欽州 535000；2南寧市紅十字會(huì)醫(yī)院)

急性腦梗死是指多種原因引發(fā)腦組織血供突然減少或停止，組織缺血、缺氧并發(fā)生軟化和壞死所致的腦血管疾病，常伴有不同程度的神經(jīng)功能缺損，重者可終身殘疾甚至死亡，該病多發(fā)于中老年人，近年來(lái)發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)[1,2]。早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)評(píng)估急性腦梗死病情嚴(yán)重程度，對(duì)臨床制定針對(duì)性治療方案及改善患者預(yù)后有重要價(jià)值。頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是急性腦梗死的重要病理基礎(chǔ)，斑塊不穩(wěn)定破裂后阻塞血管并形成血栓栓塞，最終導(dǎo)致動(dòng)脈血流量減少而致急性腦梗死[3]。炎性細(xì)胞因子與頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展相關(guān)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞及活化的T細(xì)胞等分泌的促炎因子，研究證實(shí)[4]，IL-6通過(guò)引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)而介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為17～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，研究[5]表明，miRNA特異結(jié)合mRNA的3′UTR端，通過(guò)抑制miRNA的翻譯或使其加速降解而調(diào)控下游靶基因。Let-7f屬miRNA家族成員，通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮功能而在急性心肌梗死過(guò)程中發(fā)揮作用[6]，Let-7f表達(dá)異常還介導(dǎo)了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7,8]。關(guān)于Let-7f、IL-6聯(lián)合檢測(cè)與急性腦梗死的關(guān)系，目前相關(guān)研究尚不多。2017年3月～2019年3月，我們觀察了急性腦梗死患者血清let-7f、IL-6水平變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年3月～2019年3月經(jīng)欽州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治為急性腦梗死的109例患者為病例組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病突然，典型臨床表現(xiàn)包括頭痛、眩暈、耳鳴、半身不遂等，常伴有惡心嘔吐，嚴(yán)重者快速昏迷；②經(jīng)頭部CT、MRI檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查等確診為急性腦梗死，并符合中國(guó)急性缺血性卒中診治指南(2014年)[9]中急性腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)；③首次發(fā)病，且發(fā)病至入院時(shí)間<3 d；④年齡≥18歲；⑤獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)；⑥患者家屬知情同意，并在知情同意書上簽字。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕產(chǎn)婦及哺乳期女性；②心臟功能不全者；③肝、腎功能障礙者；④既往有腦梗死病史者；⑤急、慢性炎癥性疾病患者；⑥自身免疫性疾病患者；⑦近2個(gè)月內(nèi)有外傷史或接受過(guò)重大手術(shù)治療患者；⑧惡性腫瘤患者；⑨其他可能影響本研究結(jié)果的疾病患者；⑩入組前1個(gè)月內(nèi)接受過(guò)類固醇激素或抗炎藥治療者。根據(jù)頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度(IMT)[10]將患者分為頸動(dòng)脈正常組(IMT<1.2 mm且頸動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整)共51例，頸動(dòng)脈斑塊組(IMT≥1.2 mm)共58例。其中頸動(dòng)脈斑塊組又分為穩(wěn)定性斑塊組(n=32)和不穩(wěn)定性斑塊組(n=26)。頸動(dòng)脈正常組男27例、女24例，年齡(63.28±5.19)歲，BMI(23.24±2.57)kg/m2，高血壓22例，糖尿病15例，有飲酒史16例，空腹血糖(5.77±0.79)mmol/L，甘油三酯(TG)為(1.52±0.27)mmol/L，總膽固醇(TC)為(4.51±0.56)mmol/L，高密度脂蛋白(HDL-C)為(1.03±0.34)mmol/L，低密度脂蛋白(LDL-C)為(3.26±0.64)mmol/L。不穩(wěn)定性斑塊組男17例、女15例，年齡(64.07±4.96)歲，BMI(22.57±2.81)kg/m2。高血壓17例，糖尿病11例，有飲酒史10例，空腹血糖(5.86±0.72)mmol/L，TG為(1.39±0.34)mmol/L，TC為(4.62±0.50)mmol/L，HDL-C為(0.99±0.31)mmol/L，LDL-C為(3.21±0.59)mmol/L。不穩(wěn)定性斑塊組男15例、女11例，年齡(63.28±5.11)歲，BMI(23.06±2.77)kg/m2，高血壓16例，糖尿病9例，有飲酒史9例，空腹血糖(5.69±0.80)mmol/L，TG為(1.59±0.39)mmol/L，TC為(4.49±0.52)mmol/L，HDL-C為(1.04±0.30)mmol/L，LDL-C為(3.30±0.62)mmol/L。隨機(jī)選取同期于我院體檢中心查體健康的60例體檢者為對(duì)照組，近2個(gè)月內(nèi)無(wú)外傷史，同時(shí)未進(jìn)行過(guò)重大手術(shù)治療，無(wú)其他可能影響本研究的疾病。對(duì)照組男37例、女23例，年齡(62.97±5.82)歲，BMI(23.10±2.34)kg/m2，高血壓14例，糖尿病7例，有飲酒史19例，空腹血糖(5.73±0.76)mmol/L，TG為(1.46±0.32)mmol/L，TC為(4.56±0.67)mmol/L，HDL-C為(1.17±0.28)mmol/L，LDL-C為(2.96±0.55)mmol/L。四組性別、年齡、BMI、飲酒史、空腹血糖、TG、TC比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，與對(duì)照組比較，病例組高血壓史、糖尿病史比例較高，血清HDL-C水平降低，血清LDL-C水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

1.2 血清IL-6檢測(cè) 收集病例組患者入院次日清晨空腹肘靜脈血5 mL，健康體檢者于體檢當(dāng)日抽取，將血液標(biāo)本于非抗凝管中靜置5 min，3 000 r/min，離心10 min，離心半徑為12 cm，留取上清液置于-80 ℃環(huán)境下保存，留待檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清IL-6，酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自上海佳和生物科技有限公司，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行。

1.3 血清Let-7f mRNA檢測(cè) 提取RNA：將TRIzol試劑(上海閃晶分子生物科技有限公司)以1∶1加入到3 mL血清標(biāo)本中，混勻后以苯酚/氯仿去除蛋白質(zhì)后加入0.5 mL的乙醇沉淀RNA，并將焦炭酸二乙酯(DEPC)加入其中溶解，根據(jù)紫外分光光度法對(duì)總RNA進(jìn)行提取，提取OD260/OD280≥1.8的RNA，在低溫環(huán)境下保存。RNA試劑盒購(gòu)自北京康為公司。

cDNA合成：按照RevertAidr First strand cDNA Synthesei試劑盒的說(shuō)明合成cRNA，反應(yīng)體系：1 μL/Conc的總RNA，1 μL的5×miScript RT Buffer，1 μL的miScript Reverse Transcriptase Mix，加H2O直至20 μL體積，在RT反應(yīng)體系中混勻后進(jìn)行孵育反轉(zhuǎn)錄，溫度為40 ℃，持續(xù)60 min，然后孵育滅火反轉(zhuǎn)錄酶，溫度為90 ℃，持續(xù)10 min。

RT-qPCR反應(yīng)：在去RNase的PCR管中加入適量cDNA，并在其中加入正反向引物，按照試劑盒上的相關(guān)說(shuō)明操作。let-7f mRNA正向引物：5′-GTTTACCTGAAGAGCTCTGGTAC-3′，反向引物：5′-CCTTATCTGCTAGTGTCGACATCAT-3′，長(zhǎng)度為249 kb，β-actin為內(nèi)參基因，正向引物：5′-TGACGAGACCTCTATGCCGACTC-3′，反向引物：5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，長(zhǎng)度為265 kb。建立10 μL的反應(yīng)體系：5 μL的2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer，0.4 μL的10 μmol/L的Forward primer，0.4 μL的10 μmol/L的Reverse primer，0.2 μL的SuperEnzyme Mix，0.6 μL的RNA Template，3.4 μL的Rnase-Free Water。反應(yīng)條件：預(yù)變性，95 ℃持續(xù)10 min，循環(huán)40次；變性，95 ℃持續(xù)30 s；退火，56 ℃持續(xù)20 s；延伸，72 ℃持續(xù)40 s，收集熒光信號(hào)。let-7f mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT表示，所有樣本重復(fù)3次，其中ΔCT=(let-7f平均CT)-(β-actin平均CT)，ΔΔCT為(let-7f的ΔCT)-(校準(zhǔn)標(biāo)本ΔCT)，CT為熒光信號(hào)在每個(gè)PCR管內(nèi)到達(dá)設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組血清IL-6、let-7f mRNA水平比較 頸動(dòng)脈正常組、穩(wěn)定性斑塊組、不穩(wěn)定性斑塊組、對(duì)照組血清IL-6水平分別為(57.78±28.56)、(96.22±29.18)、(137.29±25.43)、(16.51±27.30)ng/L，四組血清IL-6水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=133.853，P=0.000)。病例組血清IL-6水平高于對(duì)照組，并且斑塊越不穩(wěn)定，血清IL-6水平越高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。頸動(dòng)脈正常組、穩(wěn)定性斑塊組、不穩(wěn)定性斑塊組、對(duì)照組血清let-7f mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.32±0.41、0.98±0.44、0.61±0.39、2.24±0.45，四組血清let-7f mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=116.054，P=0.000)。病例組血清let-7f mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，且斑塊越不穩(wěn)定，血清let-7f mRNA表達(dá)下調(diào)越顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2 急性腦梗死患者血清let-7f mRNA、IL-6水平與頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系 秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，急性腦梗死患者血清let-7f mRNA與斑塊穩(wěn)定性呈正相關(guān)(rs=0.638，P<0.05)，血清IL-6與斑塊穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.609，P<0.05)。此外，let-7f mRNA與IL-6呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.712，P<0.05)。

2.3 血清let-7f mRNA、IL-6對(duì)急性腦梗死的診斷價(jià)值 let-7f mRNA診斷急性腦梗死的ROC曲線下面積(AUC)為0.830(95%CI：0.748～0.913)，約登指數(shù)為0.671，此時(shí)最佳截?cái)嘀禐?.922，靈敏度、特異度分別為0.83、0.77，準(zhǔn)確性為0.82；IL-6診斷急性腦梗死ROC的AUC為0.812(95%CI：0.726～0.899)，約登指數(shù)為0.598，此時(shí)最佳截?cái)嘀禐?8.37 ng/L，靈敏度、特異度分別為0.80、0.72，準(zhǔn)確性為0.75；兩指標(biāo)聯(lián)合診斷急性腦梗死的AUC為0.903(95%CI：0.840～0.966)，靈敏度、特異度分別為0.89、0.82，準(zhǔn)確性為0.87。見(jiàn)圖1。

圖1 血清lef-7f mRNA、IL-6診斷急性腦梗死的ROC曲線

3 討論

miRNA是廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，在人體中特異度表達(dá)并穩(wěn)定存在，主要參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程[11]，miRNA還具有致癌和抑癌作用，參與肝癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12,13]。let-7家族成員主要包括let-7a、let-7f、miRNA-98等，是常見(jiàn)的一類miRNA。Ge等[14]研究顯示，let-7f mRNA在肝癌患者中表達(dá)下調(diào)，且與患者臨床病理特征密切相關(guān)。研究還顯示[15]，Let-7f過(guò)表達(dá)可抑制Blimp-q表達(dá)，導(dǎo)致TNF-α、IFN-γ、IL-6等炎性細(xì)胞因子釋放，加重炎癥反應(yīng)，在小鼠體內(nèi)敲除let-7f基因可促進(jìn)Blimp的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。此外，let-7f對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化具有抑制功能，通過(guò)趨化中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等促進(jìn)炎癥因子釋放[16,17]。Lin等[18]發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中，let-7f表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致炎性因子如腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)及血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)等水平升高，同時(shí)引起細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)沉淀，最終促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊形成，引起斑塊破裂等。IL-6是由單核細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等合成并分泌的具有多種生物學(xué)功能的炎性因子。研究發(fā)現(xiàn)[19]，IL-6分泌使血腦屏障破壞增加，自由基形成及興奮性氨基酸釋放，加速凝血和血栓形成，堵塞血管，形成動(dòng)脈粥樣硬化，IL-6還能介導(dǎo)凝血因子合成而影響氧化型低密度脂蛋白攝入，參與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程。可見(jiàn)，let-7f和IL-6在炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中有重要作用。

本研究納入的急性腦梗死患者與健康體檢者相比，高血壓和糖尿病患者占比較高，且HDL-C降低和LDL-C升高。大量研究已表明，高血壓、糖尿病是引起動(dòng)脈血管硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[20]，而血脂異常與急性腦梗死密切相關(guān)，定期監(jiān)測(cè)血脂指標(biāo)對(duì)預(yù)防腦血管病有積極意義[21]。本研究結(jié)果顯示，病例組血清let-7f mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，血清IL-6水平高于對(duì)照組，提示血清let-7f mRNA表達(dá)下調(diào)，IL-6水平升高可能參與了急性腦梗死發(fā)病過(guò)程。Let-7f mRNA下調(diào)引起細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性增加而使細(xì)胞不斷增殖分化，導(dǎo)致血管內(nèi)壁增厚和管腔變狹窄，血供減少；低表達(dá)的let-7f mRNA使血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞而暴露內(nèi)部的膠原組織并釋放組織因子，使血小板聚集于表面，凝血反應(yīng)鏈激活刺激并增加免疫球蛋白、纖維蛋白含量；let-7f mRNA表達(dá)降低還參與調(diào)控細(xì)胞的趨化作用和定向性轉(zhuǎn)移，使中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的趨化因子受體激活而使血液處于高凝及纖溶亢進(jìn)狀態(tài)，并增加血液的黏滯性及凝固性，形成血栓前狀態(tài)，上述機(jī)制最終誘發(fā)急性腦梗死[22]。IL-6可通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)，誘導(dǎo)生物活性物質(zhì)如組胺、激肽等合成和釋放，引起機(jī)體微循環(huán)障礙，血液處于高凝狀態(tài)，血栓形成，參與急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展[22]；IL-6還能介導(dǎo)高敏C-反應(yīng)蛋白的釋放而參與動(dòng)脈粥樣硬化形成，并最終引發(fā)急性腦梗死。

進(jìn)一步分析顯示，急性腦梗死患者血清let-7f mRNA與頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，即let-7f mRNA表達(dá)越低，斑塊穩(wěn)定性越差，可能與let-7f mRNA表達(dá)越低，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化越明顯，炎性細(xì)胞趨化作用越強(qiáng)，由此導(dǎo)致的炎性細(xì)胞因子濃度越高，更多的血小板附著、聚集，越易形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊并使其不穩(wěn)定甚至破裂。此外，血清IL-6與斑塊穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，即IL-6水平越高，頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性越差，可能是因持續(xù)的炎癥反應(yīng)引起白細(xì)胞和血小板過(guò)量聚集，并不斷釋放炎癥介質(zhì)使血管壁穩(wěn)態(tài)破壞，引起纖維冒潰瘍及斑塊破裂。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)血清let-7f mRNA與IL-6呈負(fù)相關(guān)性，同時(shí)兩者通過(guò)相互作用共同介導(dǎo)頸動(dòng)脈斑塊的破裂而誘發(fā)急性腦梗死。其機(jī)制可能與let-7f mRNA與炎癥反應(yīng)密切有關(guān)，let-7f mRNA表達(dá)下調(diào)可抑制Blimp-q表達(dá)，提高促炎因子如IL-6的釋放。血清let-7f mRNA、IL-6診斷急性腦梗死具有較大價(jià)值，兩者的AUC分別為0.830、0.812，靈敏度、特異度相近，分別為0.83、0.77和0.80、0.72，兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.903，靈敏度、特異度為0.89、0.82，提示二者可作為診斷急性腦梗死的重要標(biāo)志物。

綜上所述，血清let-7f mRNA表達(dá)下調(diào)，IL-6表達(dá)升高，二者參與了急性腦梗死的發(fā)病過(guò)程，且與頸動(dòng)脈斑塊形成及穩(wěn)定性密切相關(guān)；二者早期聯(lián)合檢測(cè)有助于急性腦梗死的診斷。