子癇前期孕婦血清及胎盤組織中色素上皮衍生因子、血管內(nèi)皮生長因子蛋白的表達(dá)變化

黃淑暉，陳小青，謝小花，章琦，徐爽

(江西省婦幼保健院，南昌330006)

子癇前期是妊娠期特發(fā)之一疾病，發(fā)病率為2%～8%[1]，血管生成因子和抗血管生成因子間的調(diào)節(jié)失衡密切相關(guān)[2,3]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)是血管重構(gòu)過程中重要的因子。在CoCl2誘導(dǎo)的缺氧條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的VEGF/PEDF顯著升高，表明VEGF/PEDF平衡與新生血管形成程度密切相關(guān)[3]。VEGF降低、PEDF升高可能與子癇前期發(fā)病有關(guān)[4，5]，但VEGF、PEDF表達(dá)對子癇前期胎兒宮內(nèi)發(fā)育的影響研究較少。為此，我們隨機(jī)選擇2015年8月～2016年8月臨床確診為子癇前期及同期正常孕婦，檢測血清和胎盤組織中PEDF、VEGF蛋白表達(dá)，探討VEGG、PEDF蛋白與子癇前期及子癇前期合并胎兒宮內(nèi)生長受限(FGR)發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選取2015年8月～2016年8月于江西省婦幼保健院順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)分娩的子癇前期孕婦75例,納入標(biāo)準(zhǔn)按全國高等醫(yī)藥院校教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版，同期分娩的健康晚期孕婦30例為對照組。兩組孕婦均為單胎，無其他內(nèi)科和產(chǎn)科合并癥，懷孕前無其他疾病，如慢性高血壓、腎病、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)或減退、血栓或出血性疾病等。將75例子癇前期孕婦分為輕度子癇前期(MPE)組30例和重度子癇前期(SPE)組45例，其中SPE組未合并FGR 27例，合并FGR 18例。MPE組年齡(27.87±4.39)歲，身高(160.27±4.39)cm，體質(zhì)量(70.57±10.06)kg，孕次(2.63±1.27)次，孕周(251.43±29.70)d。SPE組年齡(28.76±6.33)歲，身高(158.16±3.88)cm，體質(zhì)量(71.74±8.65)kg，孕次(2.78±1.66)次，孕周(239.58±26.80)d。對照組年齡(27.33±3.52)歲，身高(159.90±4.03)cm，體質(zhì)量(67.57±7.86)kg，孕次(2.37±1.35)次，孕周(271.42±14.17)d。三組年齡、身高、體質(zhì)量、孕次比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，三組間孕周逐步減小(SPE組< MPE組<對照組)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.785，P<0.05)。

1.2 血清及胎盤組織中PEDF、VEGF檢測方法 收集孕婦外周靜脈血4 mL，1 200 r/min離心5 min，抽取上層血清置于-80 ℃冰箱保存。ELISA法檢測三組血清PEDF、VEGF，具體操作方法參照試劑盒說明書進(jìn)行，VEGF、PEDF酶聯(lián)免疫試劑盒購置上海卡努生物科技有限公司。在胎盤娩出后5 min內(nèi)，避開出血、鈣化灶，直視下取中央絨毛組織，無菌生理鹽水漂洗去除血液至上清液無色后，取約1 cm×1 cm×1 cm組織2或3份，放入凍存管中-80 ℃保存。采用Western blotting法檢測分娩后胎盤組織中PEDF、VEGF蛋白(VEGF抗體，bioss公司，貨號bs-0279R；PEDF抗體，Bioss公司，貨號bs-20784R)表達(dá)。選擇正常妊娠孕婦分娩后胎盤組織15例份，SPE未合并FGR孕婦分娩后胎盤組織15例份、SPE合并FGR孕婦分娩后胎盤組織15例份，胎盤組織蛋白經(jīng)8%-10%SDS-PAGE分離膠分離后，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用含5%(BSA或脫脂牛奶)的TBST室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜孵育。第2天用含0.1%的TBST洗膜3次，每次5 min，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。0.1%TBST洗膜后，硝酸纖維素膜以 HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對條帶進(jìn)行顯色。β-actin作為內(nèi)參對照，計(jì)算PEDF、VEGF蛋白的相對表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。ECL化學(xué)發(fā)光及圖像采集和分析：按照蛋白質(zhì)印跡檢測試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。利用凝膠成像系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific, IL, USA)采集圖像和進(jìn)行圖像分析。

1.3 各組胎兒出生體質(zhì)量、孕婦臍動(dòng)脈收縮峰值流速與舒張末期血流流速之比值(S/D)測定 采用B超測定孕婦臍動(dòng)脈S/D，稱重記錄剛出生的胎兒體質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 各組血清PEDF、VEGF水平比較 對照組、MPE組、SPE組血清PEDF水平分別為(2.11±1.85)、(3.93±1.52)、(5.09±2.12)μg/mL，血清VEGF水平分別為(1145.75±179.67)、(793.36±183.59)、(593.33±177.61)pg/mL，與對照組相比，MPE組及SPE組血清VEGF水平降低，對照組>MPE組>SPE組(F=84.995，P<0.05)，血清PEDF水平升高，對照組

2.2 SPE組合并FGR與未合并FGR孕婦血清PEDF、VEGF、胎兒出生體質(zhì)量、孕婦臍動(dòng)脈S/D值比較 SPE組未合并FGR、合并FGR者血清PEDF水平分別為(4.54±1.86)、(5.93±2.25)μg/mL，血清VEGF水平分別為(613.24±162.78)、(563.45±198.87)pg/mL，胎兒出生體質(zhì)量分別為(2.55±0.77)、(1.56±0.51)kg，孕婦臍動(dòng)脈S/D值分別為2.66±0.58、3.28±1.26，與SPE組未合并FGR孕婦比較，合并FGR孕婦血清PEDF水平升高，胎兒出生體質(zhì)量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，血清VEGF水平下降(P>0.05)；45例SPE孕婦中有5例出現(xiàn)臍動(dòng)脈舒張期血流缺失，其中未合并FGR有2例，合并FGR有3例，其余病例中，SPE合并FGR孕婦臍動(dòng)脈S/D值明顯升高(P<0.05)。

2.3 孕婦胎盤組織中PEDF、VEGF蛋白表達(dá)比較 對照組分娩后胎盤組織、SPE組未合并FGR分娩后胎盤組織、SPE組合并FGR分娩后胎盤組織中均有PEDF、VEGF蛋白條帶表達(dá)。見圖1。對照組分娩后胎盤組織、SPE組未合并FGR分娩后胎盤組織、SPE組合并FGR分娩后胎盤組織中PEDF蛋白相對表達(dá)量分別為1.14±0.52、0.97±0.38、1.33±0.45，VEGF蛋白相對表達(dá)量分別為0.70±0.21、0.86±0.43、0.64±0.18，與對照組相比，SPE組未合并FGR和合并FGR孕婦胎盤組織中VEGF蛋白相對表達(dá)量減少，對照組SPE組未合并FGR孕婦>SPE組合并FGR孕婦(F=17.984，P<0.05)。

注：1為對照組;2為SPE組未合并FGR;3為SPE組合并FGR。

圖1 胎盤組織中PEDF、VEGF蛋白表達(dá)電泳圖

2.4 孕婦臍動(dòng)脈S/D值、胎兒出生體質(zhì)量比較 對照組、MPE組、SPE組胎兒體質(zhì)量分別為(3.28±0.59)、(3.25±0.32)、(2.14±0.83)kg，與對照組相比，MPE組及SPE組胎兒出生體質(zhì)量下降，對照組

3 討論

正常胎盤血管床生成依賴于胎盤內(nèi)血管生成誘導(dǎo)因子與抑制因子的平衡，胎盤微環(huán)境的改變能促進(jìn)血管生成介質(zhì)的不平衡，而此可能與不良圍產(chǎn)結(jié)局相關(guān)。在子癇前期、胎兒生長受限、自發(fā)性流產(chǎn)、胎盤早剝等疾病中，均存在血管生成失衡。子癇前期患者處于抗血管生成狀態(tài)，表現(xiàn)為抑制血管生成、對內(nèi)皮有損傷作用的sFlt-1和sEng升高，VEGF與大量可溶性受體結(jié)合，而與胞膜上受體結(jié)合過程被抑制，導(dǎo)致血管生成處于抑制狀態(tài)[1]。

VEGF 是一種自分泌和旁分泌生長因子，具有高度的保守性，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、遷移，誘導(dǎo)血管新生，提高血管通透性，在維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及促進(jìn)血管發(fā)生中有重要作用[6]。VEGF參與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤、增殖和分化及胎盤血管生成、血管重構(gòu)等方面。流產(chǎn)、子癇前期、FGR等病理情況下，VEGF表達(dá)低于正常妊娠水平[7～9]，導(dǎo)致出現(xiàn)胎盤缺血、缺氧及全身小血管痙攣等一系列變化。此外，VEGF表達(dá)降低亦會(huì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞的損傷修復(fù)，胎盤血流灌注進(jìn)一步減少，加劇子癇前期病情。本研究顯示，子癇前期孕婦血清VEGF水平降低，且隨病情加重而進(jìn)一步降低，支持以上研究結(jié)果。

PEDF是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中廣泛表達(dá)的一種多功能因子，由Tombran-Tink等1989年從胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分離得到。研究表明，PEDF在諸多病理生理過程中發(fā)揮重要作用，具有營養(yǎng)和保護(hù)神經(jīng)、抑制血管形成、調(diào)節(jié)血管通透性、促進(jìn)腫瘤分化和凋亡功能，是目前已知最強(qiáng)的天然血管形成抑制劑，可顯著下調(diào)VEGF表達(dá)[10,11 ]，可引起有活性的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗血管生成的作用。PEDF在女性生殖系統(tǒng)中高度表達(dá)，受卵巢類固醇激素調(diào)控[12]，且與卵巢過度刺激綜合征、子癇前期、妊娠期糖尿病等發(fā)病有關(guān)[5,13,14]。PEDF可能是胎盤血管形成的靜止因子，與VEGF之間存在一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，共同維持血管的穩(wěn)態(tài)，一旦他們之間的平衡被打破，則會(huì)導(dǎo)致病理妊娠及影響胎兒發(fā)育。

本研究結(jié)果顯示，與正常妊娠孕婦相比，子癇前期者胎兒體質(zhì)量下降，臍動(dòng)脈S/D值升高，循環(huán)VEGF表達(dá)降低，PEDF水平增加，循環(huán)PEDF/VEGF值升高，且隨病情加重而升高。Wu等[5]研究表明，子癇前期患者胎盤組織中PEDF表達(dá)升高，而VEGF表達(dá)及MVD下降，且與PEDF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測PEDF可能參與子癇前期發(fā)生發(fā)展。植入性前置胎盤患者胎盤PEDF mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，而VEGF明顯升高，胎盤PEDF表達(dá)與胎盤VEGF、MVD及胎盤植入深度呈負(fù)相關(guān)[15]，筆者推測PEDF可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)來抑制或逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮的過度侵襲。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，攜帶PEDF基因的腺病毒轉(zhuǎn)染胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移有抑制作用[16]。PEDF可通過抑制VEGF誘導(dǎo)VEGFR-1的磷酸化及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移及血管滲漏，對抗VEGF的促血管生成作用，抑制血管再生，從而維持血管的靜止?fàn)顟B(tài)和正常血管的完整性[17]。在晚孕期胎盤，PEDF還以調(diào)節(jié)VEGF的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)為靶點(diǎn)，通過ERK1/2和FAK的磷酸化途徑，影響VEGF誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和遷移，參與限制妊娠晚期胎兒胎盤內(nèi)皮細(xì)胞的生長和擴(kuò)張[18]。我們將SPE組分為合并FGR及未合并FGR，分析發(fā)現(xiàn)合并FGR的SPE者VEGF表達(dá)進(jìn)一步下降，PEDF表達(dá)及臍帶S/D值進(jìn)一步升高，且有5例出現(xiàn)臍動(dòng)脈舒張期血流缺失，循環(huán)PEDF升高，Baqheri等[8]研究發(fā)現(xiàn)，血清VEGF水平與新生兒體質(zhì)量、Apgar評分呈正相關(guān)，推測VEGF降低可能與胎兒生長發(fā)育受到抑制有關(guān)。子癇前期PEDF升高，VEGF下降，PEDF、VEGF表達(dá)失衡，血管生成因子被抑制，抗血管生成因子增加，可能影響了胎盤血管生成，從而誘發(fā)子癇前期的發(fā)生，當(dāng)PEDF進(jìn)一步升高，VEGF進(jìn)一步下降，導(dǎo)致螺旋動(dòng)脈痙攣，血流阻力增高，胎盤缺血、缺氧加重，影響胎兒生長發(fā)育。

綜上所述，PEDF、VEGF表達(dá)異常在子癇前期及子癇前期合并FGR發(fā)病中可能起特殊作用，PEDF/VEGF平衡紊亂可能影響胎盤血管生成，加重子癇前期進(jìn)程，導(dǎo)致出現(xiàn)FGR。