結直腸癌組織中PCDH7基因啟動子甲基化狀態及意義

代晨，韓野，高官壯，陳震龍，郭興坡，周友鑫，匡玉庭

(蘇州大學附屬第一醫院，江蘇蘇州 215000)

結直腸癌是目前威脅人類健康的主要消化系統惡性腫瘤之一。在世界范圍內，結直腸癌已成為第三常見的惡性腫瘤[1,2]。近年來，我國結直腸癌的發病率呈上升趨勢[2,3]。外科手術是治療結直腸癌的最有效手段，但無論是手術治療、術前新輔助放化療還是術后放化療對結直腸癌患者整體生存率的提升效果并不理想，患者的5年生存率仍偏低，多數患者死于腫瘤復發及轉移，而結直腸癌的發生發展及復發轉移與體內癌基因、抑癌基因表達水平密切相關。表觀遺傳學是研究基因在核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達出現可遺傳變化的一門遺傳學分支學科。表觀遺傳的研究內容包括DNA甲基化、基因組印記、母體效應、基因沉默、核仁顯性及RNA編輯等[4]。有研究表明，DNA甲基化在腫瘤的發生發展中有重要作用。抑癌基因啟動子區域CpG島高甲基化導致抑癌基因失活進而與腫瘤的進展、遷移和侵襲密切相關。PCDH7(BH-Pcdh)基因定位于人染色體4p15，作為原鈣黏蛋白家族中重要成員，能調節細胞黏附，對胚胎發育過程中的細胞識別、遷移和組織分化及成體組織器官構成有重要作用[5]。近年有研究表明，PCDH7在某些腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。如PCDH7基因高表達與乳腺癌和肺癌的腦轉移或骨轉移相關[6～9]。然而更多的研究則表明原鈣黏蛋白(PCDH)家族在胃、膀胱、腎臟等惡性腫瘤形成過程中起到明顯抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡的作用[10～13]。目前有關PCDH7 基因在結直腸癌中的作用及相關分子機制無系統的研究報道。2017年10月～2019年3月，我們探討了PCDH7基因啟動子區甲基化狀態與結直腸癌發生發展及患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院普外科2013年1～12月行結直腸癌根治術且經病理切片證實的原發性結直腸癌患者癌組織標本及其相應癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)標本各72例份。患者術前均未行放、化療及靶向藥物治療且具有完整的臨床資料。72例原發性結直腸癌患者中，男45例、女27例，年齡30～81(53.7±8.8)歲。臨床病理檢查結果顯示，高分化6例,中分化21例，低分化35例，未分化10例；Ⅰ期14例，Ⅱ期11例，Ⅲ期23例，Ⅳ期24例；淋巴結轉移51例。切除的腫瘤組織及相應癌旁正常組織標本即刻放入液氮中速凍，后放入-80 ℃冰箱保存。患者經手術開始隨訪至2018年12月。患者或家屬均簽署知情同意書，且本研究經蘇州大學附屬第一醫院倫理委員會批準通過。

1.2 PCDH7啟動子甲基化狀態檢測 運用甲基化特異性PCR(MSP)檢測。使用DNA抽提試劑盒并按照試劑盒的說明提取腫瘤組織及癌旁正常組織中的DNA。之后對DNA進行亞硫酸氫鈉的處理。運用urogene網站(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)并參照NCBI所給出的DNA序列設計PCDH7的甲基化引物及非甲基化引物，并選擇引物1作為后續的研究。甲基化引物(M)：正向引物為5′-TTTTGTTTCGTTATTTAGGTTTCGT-3′，反向引物為5′-AAATTTACTTAATCTTCAACTCGCC-3′；非甲基化引物(U)：正向引物為5′-TTTTGTTTTGTTATTTAGGTTTTGT-3′，反向引物為5′-AAAATTTACTTAATCTTCAACTCACC-3′。以修飾后的DNA為模板使用MSP進行擴增，PCR反應體系為25 μL，包括Taq酶0.2 μL和修飾后的DNA樣品2 μL，具體檢測及操作步驟按照試劑盒所給說明書進行。反應條件采用95 ℃ 10 min的預變性；95 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，并采用自動成像儀照相分析。實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。PCDH7基因啟動子區甲基化情況與患者臨床病理特征間的關系使用四格表χ2檢驗。使用乘積限法(Kaplan-Meier法)估計生存率、繪制生存曲線，比較兩組間生存率的差異采用Log-rank趨勢檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCDH7基因啟動子區域的CpG島分布及MSP引物的設計 運用在線網站(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)對PCDH7基因的啟動子區域進行分析并且顯示出了CpG島在其啟動子區域的分布情況，同時設計出MSP引物(圖1)。

2.2 結直腸癌組織與相應癌旁正常組織中PCDH7基因啟動子區甲基化狀態 結直腸癌組織中PCDH7基因啟動子區甲基化率為58%(42/72)，而癌旁正常組織中PCDH7基因啟動子區甲基化率為19%(14/72)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=22.91，P<0.05)，見圖2。

圖1 CpG島在PCDH7啟動子區的分布及MSP引物的設計

注：N為正常組織；T為腫瘤組織；Pos為陽性對照；Neg為陰性對照；M為甲基化反應；U為非甲基化反應。

圖2 結直腸癌組織和癌旁正常組織中PCDH7基因啟動子甲基化狀態

2.3 結直腸癌組織中PCDH7基因啟動子區甲基化與患者臨床病理特征的關系 PCDH7啟動子區(CpG島)甲基化與腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移和TNM分期有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡無關(P均>0.05)。見表1。

表1 PCDH7基因啟動子區甲基化狀態與結直腸癌患者臨床病理特征的關系(例)

2.4 PCDH7基因甲基化狀態與結直腸癌患者預后相關性 對納入的72例結直腸癌患者隨訪觀察。通過2～60個月的隨訪觀察并且將隨訪結果數據進行Kaplan-Meier 生存分析,結果表明甲基化患者的5年生存率低于非甲基化患者(P<0.01)，見圖3。

圖3 甲基化與非甲基化結直腸癌患者生存曲線

3 討論

表觀遺傳學是研究基因在核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達出現可遺傳變化的一門遺傳學分支學科。表觀遺傳的研究內容包括DNA甲基化、基因組印記、母體效應、基因沉默、核仁顯性以及RNA編輯等[4]，其中DNA甲基化是最早發現的一種基因表觀修飾的類型。DNA甲基化是指在甲基轉移酶的催化下，基因組CpG 二核苷酸胞嘧啶5′碳位上選擇性地添加一個甲基基團，形成5′甲基胞嘧啶[14]。在雙鏈DNA分子中，坐落于雙螺旋結構主鏈部分的甲基基團可被甲基化CpG結合域蛋白所識別，接著在DNA復制過程中，位于新合成子鏈上的未甲基化的CpG島在DMNT1的作用下甲基化。在DNMT的作用下，胞嘧啶變成5′甲基胞嘧啶，然后5′甲基胞嘧啶在DNA區甲基化酶的作用下轉變成5hmC、5fC、5caC，最后胞嘧啶經過TDG/BER介導的堿基修復被重新合成，這就構成了一個完整的循環[15]。在細胞早期發育階段，細胞的生長及分化依賴于甲基化與非甲基化的交替進行，且這一過程與細胞的正常發育及基因組的穩定密切相關[16]。近年來研究表明，基因甲基化與腫瘤的發生發展密切相關。腫瘤中常存在基因啟動子區甲基化水平的降低或異常升高。原癌基因可因基因組整體甲基化水平的降低而活化，抑癌基因可因基因啟動子區CpG島發生異常高甲基化而使其表達明顯下調或不表達，而某些基因是信號通路的關鍵分子，這些基因啟動子的異常甲基化可引起該信號通路的激活或失活，上述這些變化均會促進腫瘤的發生[16]。基因甲基化所導致的基因失活在腫瘤發生發展中扮演重要角色[17]。DNA甲基化和基因突變常發生于基因啟動子區的CpG島上，有研究表明異常高甲基化經常發生在癌細胞中的抑癌基因啟動子區CpG島上，抑癌基因啟動子區域CpG 島甲基化程度的增加可明顯增加染色體的螺旋程度，從而抑制抑癌基因的表達，而在正常體細胞中這些抑癌基因啟動子區的CpG島上大部分是未甲基化的[18]。基因異常甲基化的發生常在腫瘤發生之前就已存在，并且腫瘤細胞壞死凋亡所產生的DNA可釋放到血清、血漿等體液當中，因此檢測體液中某些基因的異常甲基化可作為腫瘤早期診斷的有效方法。當然，DNA甲基化對于預測腫瘤患者的預后亦具有重要意義。

鈣黏蛋白超家族是一個由多樣化的膜相關糖蛋白組成的家族，該蛋白家族有共同的結構特征：由相對較大的胞外結構域和相對較小的胞質結構域組成，這些結構域通過跨膜結構域彼此連接，Ca2+就結合在重復結構域之間，從而賦予鈣黏蛋白分子剛性和強度[5]。基于其分子結構，鈣黏蛋白超家族可大致分為4類：經典鈣黏蛋白、橋粒鈣黏蛋白、PCDH及其他種類的鈣黏蛋白相關蛋白[19]。PCDH有7個胞外結構域與1個跨膜區和細胞質部分。研究表明，PCDH存在于不同的組織中，他們作為細胞識別分子及信號轉導通路中的組成部分而發揮重要作用[5]；PCDH與胚胎時期神經系統的成熟密切相關；亦有研究表明，PCDH與部分神經系統疾病包括認知障礙、自閉癥及精神分裂分裂癥等病的發生密切相關。近年研究表明，PCDH可影響腫瘤的發生發展，如PCDH17在結直腸癌組織中的表達水平升高后，結直腸癌細胞的增殖能力下降，凋亡增加[20]；此外，有研究表明，在人結直腸癌細胞中，PCDH10基因由于啟動子區甲基化而造成其表達水平降低從而導致結直腸癌細胞增殖及遷移能力的提升[21]。

PCDH7作為PCDH家族中重要成員，其mRNA表達主要集中于心臟和腦中，而在甲狀腺、胃、胎盤和脊髓中較少[5]，且能調節細胞黏附，對胚胎發育中的細胞識別、遷移和組織分化及成體組織器官構成有重要作用。Lin等[12]研究表明，PCDH7在原發性非肌肉侵襲性膀胱癌中表達水平降低且PCDH7表達水平與原發性非肌肉侵襲性膀胱癌的病理分級、復發及進展密切相關。Chen等[22]研究發現，PCDH7通過影響并改變E-cadherin的表達水平從而抑制胃癌的轉移、侵襲及進展。PCDH7在腫瘤中可能發揮了抑癌作用，而其發揮抑癌作用的具體機制在不同腫瘤中卻不盡相同。正如Beukers等[23]研究表明，PCDH7在不同年齡段膀胱癌患者中的甲基化率要明顯高于正常人，其在結直腸癌中的作用及其可能的分子機制無系統的研究報道。基于上述觀點，我們猜測PCDH7 基因很可能作為一種新的結直腸癌候選抑癌基因，并且其啟動子區域的高甲基化狀態可能是PCDH7 基因在結直腸癌中失活的主要機制之一。

為了驗證上述猜測，我們進行了相關研究。本研究結果顯示，72例份結直腸癌組織中，42 例份存在PCDH7啟動子區甲基化，甲基化率為58%；而癌旁正常組織中PCDH7基因啟動子區甲基化率為19%，結直腸癌組織中的PCDH7基因甲基化率明顯高于對應的癌旁正常組織，說明PCDH7基因啟動子甲基化情況可能與結直腸癌的發生發展密切相關。另外我們發現，PCDH7基因啟動子區呈現甲基化狀態的結直腸癌患者的腫瘤直徑更大、分化程度更低、TNM分期更晚、更易發生淋巴結轉移，提示PCDH7基因啟動子區域的異常甲基化狀態可能促進了結直腸癌的生長、進展和轉移。我們還發現，PCDH7基因甲基化的結直腸癌患者5年生存率低于非甲基化患者，差異有統計學意義，提示其可作為判斷結直腸癌患者臨床預后的一個重要生物學指標。

綜上所述，PCDH7基因作為一種抑癌基因在結直腸癌的發生發展中扮演重要角色，其啟動子區的異常甲基化與結直腸癌的生長、進展、分化及轉移密切相關，可能成為結直腸癌治療的重要靶標。但由于PCDH7基因的復雜生物學功能，其在結直腸癌發生發展中所起作用是由于單一的啟動子區甲基化導致還是同其他多種機制協同導致仍有待進一步研究及闡明，同時本研究的樣本數量相對較少，需增加樣本量來進一步驗證上述結果的準確性及可靠性。