前列腺癌組織中SKP2、Kindlin-2的表達變化及意義

張正林，蔣銀鋒，朱喜山

(常州市第三人民醫院，江蘇常州 213001)

前列腺癌是全球范圍內男性常見惡性腫瘤。2016年美國約有18.1萬新發病例，而死亡患者的病例高達2.6萬例[1]。近年來隨著診斷技術的發展，我國前列腺癌的發病率和病死率逐年增加，危害我國老年男性的身體健康。早期局限性前列腺癌可通過根治性手術、放療等達到較好的治療效果，但晚期轉移性前列腺癌及去勢抵抗前列腺癌患者預后較差[2]。S期激酶相關蛋白2(SKP2)基因位于人類染色體5p13.2，SKP2基因編碼11個外顯子，該基因編碼蛋白特征是具有約40個氨基酸的F-box基序，是構成泛素連接酶復合物的四個亞基之一，在蛋白泛素化中發揮作用[3]。SKP2蛋白能特異性識別S期的磷酸化細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B(CDKN1B，亦稱p27或KIP1)，并相互作用，參與細胞周期的調節[4]。近年來，SKP2基因被認為是一種原癌基因，參與肺癌[5]、結直腸癌[6]等多種腫瘤的發生發展。黏著斑蛋白-2(Kindlin-2)基因又稱Fermt2，位于人類13號染色體，其編碼的Kindlin-2蛋白是黏附分子蛋白的家族成員之一，能被細胞外的整合素信號活化，影響正常細胞的分化、增殖及腫瘤細胞的遷移、侵襲和凋亡等生物學行為[7,8]。劉暢等[9]研究結果顯示，前列腺癌組織中SKP2、Kindlin-2蛋白表達異常，與患者較高的腫瘤分期有關。但目前有關SKP2及Kindlin-2在前列腺癌中的作用機制及臨床價值報道較少。2013年2月～2019年2月，我們通過比較前列腺癌患者癌組織與前列腺增生(BPH)組織中SKP2和Kindlin-2 mRNA表達差異，分析兩者表達的相關性及與前列腺癌患者臨床病理特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年2月～2016 年2月就診于我院并行手術治療的90例前列腺癌患者(PCa組)的臨床病理資料。前列腺癌患者為初次診斷，既往未接受抗腫瘤、放化療等其他治療，并排除其他系統的惡性腫瘤。患者年齡52～76(62.4±6.5)歲。前列腺癌病理分級參考Gleason評分系統，Gleason評分系統和腫瘤臨床分期均參考《中國泌尿外科疾病診斷治療指南》中相關標準[10]。其中Gleason評分≤6分者39例，Gleason評分≥7分者51例。腫瘤臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期 52例，Ⅲ～Ⅳ期38例。患者初始血清PSA：7.9～145 ng/mL，中位PSA為43.5 ng/mL，其中≤20 ng/mL者37例，>20 ng/mL者53例。入院后所有患者行核素骨掃描、核磁共振等檢查，其中遠處轉移28例，無遠處轉移62例。患者術后均獲得隨訪，隨訪時間2～48個月，中位隨訪時間34.6個月，隨訪方式為門診復查或電話隨訪，復查內容主要包括患者生存狀況、有無復發等，隨訪終點為隨訪時間的結束或患者死亡，截止時間為2019年2月1日。選取同期行恥骨上前列腺摘除術的40例BPH患者BPH組織標本(BPH組)，年齡54～78(67.5±6.8)歲。本研究經我院倫理委員會批準通過，所有患者及家屬知情同意并簽字。

1.2 前列腺癌組織及BPH組織中SKP2和Kindlin-2表達檢測 采用熒光實時定量PCR法檢測。收集術中離體2 h內獲取的組織標本，-80 ℃冰箱長期保存。取約100 mg標本組織，研缽研碎后，加1 mL的TRIzol液，按RNA提取試劑盒說明書提取組織中總RNA，分光光度計檢測提取RNA的濃度和純度。按照逆轉錄試劑盒說明書(購自大連寶生物公司)進行逆轉錄合成cDNA。取2 μL模板用于qRT-PCR反應。SKP2正向引物：5′-ATGCCCCAATCTTGTCCATCT-3′，反向引物：5′-CACCGACTGAGTGATAGGTGT-3′；Kindlin-2正向引物：5′-TGGACGGGATAAGGATGCCA-3′，反向引物：5′-GACATCACGGTTCAGGTCCG-3′；內參GAPDH正向引物:5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，反向引物:3′-GCCATCACGCCACAGTTTC-5′。PCR總反應體系為20 μL，包括cDNA溶液2 μL，正向及反向引物各0.5 μL，2×SYBR Green Master Mix試劑12.5 μL、去離子純水4.5 μL。PCR反應條件：95 ℃ 變性5 min，95 ℃ 70 s、50 ℃ 延伸30 s，共40個循環。目的基因SKP2或Kindlin-2相對表達量以2-ΔΔCt值計算。

2 結果

2.1 前列腺癌組織及BPH組織中SKP2、Kindlin-2 mRNA表達及二者間的相關性 前列腺癌組織中SKP2的相對表達量為2.68±0.45，BPH組織中為0.94±0.28，前列腺癌組織中SKP2的相對表達量高于BPH組織中(t=22.563，P=0.000)；前列腺癌組織中Kindlin-2的相對表達量為1.42±0.43，BPH組織中為0.84±0.21，前列腺癌組織中Kindlin-2的相對表達量高于BPH組織中(t=8.100，P=0.000)。前列腺癌組織中SKP2與Kindlin-2的表達呈正相關(r=0.617，P=0.003)。

2.2 前列腺癌組織中SKP2、Kindlin-2表達與患者臨床病理特征的關系 前列腺癌組織中SKP2、Kindlin-2表達與病理Gleason評分和腫瘤TNM分期有關(P均<0.05)，而與患者年齡、初始PSA水平及是否遠處轉移無關(P均>0.05)。Gleason評分≥7分、Ⅲ～Ⅳ期前列腺癌患者癌組織中SKP2、Kindlin-2表達高于Gleason評分≤6分、Ⅰ～Ⅱ期患者(P均<0.05)，見表1。

表1 前列腺癌組織中SKP2、Kindlin-2表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 前列腺癌組織中SKP2、Kindlin-2表達與患者預后關系 PCa組SKP2相對表達量以平均值2.68為臨界值，分為SKP2高表達組43例，SKP2低表達組47例。SKP2高表達組、SKP2低表達組3年生存率分別為65.1%(28/43)、85.1%(40/47)，Kaplan-Meier分析(Log-rank檢驗)結果顯示，SKP2高表達組3年生存率低于SKP2低表達組(χ2=3.516，P=0.032)。以Kindlin-2相對表達量平均值1.42為臨界值，分為Kindlin-2高表達組46例，Kindlin-2低表達組44例，Kindlin-2高表達組、Kindlin-2低表達組3年生存率分別為58.6%(27/46)、93.1%(41/44)，Kaplan-Meier分析(Log-rank檢驗)結果顯示，Kindlin-2高表達組3年生存率低于Kindlin-2低表達組(χ2=3.966，P=0.046)，見圖1。

圖1 Kaplan-Meier分析不同SKP2、Kindlin-2表達前列腺癌患者的生存曲線

3 討論

亞洲男性前列腺癌的發病率低于歐美國家，但近年呈現上升趨勢，且增長速度比歐美發達國家更迅速。目前前列腺癌的治療包括觀察等待、根治性手術、根治性放療、內分泌治療及化療等，治療方案的選擇主要依據患者年齡、一般狀況、預期壽命、Gleason評分及是否伴有遠處轉移等因素決定。但由于腫瘤的異質性及基因組的不穩定性，部分患者可出現術后復發和遠處轉移等，預后較差[11]。因此，深入研究前列腺癌發生發展的機制，對于早期診斷、治療方式選擇及預后判斷有重要臨床意義。

SKP2作為一種F-box家族蛋白之一，是泛素連接酶復合物的底物識別亞基。研究表明，SKP2參與細胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk)抑制物p27(Kip1)的泛素依賴性降解，參與細胞有絲分裂過程中G2期的調節，在乳腺癌等多種腫瘤中均存在異常表達升高的現象，促進腫瘤細胞的增殖，并抑制凋亡[12]。本研究中，前列腺癌組織中SKP2表達上調,其機制尚不清楚，可能與調控SKP2表達的微小RNA(miR)339等表達降低有關[13]，有研究報道，非小細胞肺癌中miR-339表達降低，導致結合于SKP2信使RNA3′端非翻譯區減少，其抑制SKP2基因表達能力下降，SKP2表達增加[14]。此外,本研究中Gleason評分≥7分、Ⅲ～Ⅳ期前列腺癌患者癌組織中SKP2表達高于Gleason評分≤6分、Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統計學意義，表明SKP2參與腫瘤發展。其原因一方面是SKP2表達增加能通過抑制Cdk抑制物，促進腫瘤細胞周期的發展，腫瘤細胞G1/S期比例升高，導致腫瘤分期增高。另一方面，SKP2能促進上皮間質轉化過程中的關鍵轉錄因子Twist表達，導致腫瘤細胞發生上皮間質轉化，細胞異型性增加，Gleason評分升高[15]。本研究進一步分析不同SKP2表達水平患者3年生存率的差異，結果高SKP2表達患者3年生存率明顯降低。表明SKP2有可能成為新的提示前列腺癌預后的分子生物學標志物。

Kindlins家族成員是共同含有FERM結構域的蛋白質分子，含有FERM結構域蛋白的典型F1、F2和F3亞結構域。哺乳動物中有三種Kindlin家族成員，分別為Kindlin-1、Kindlin-2和Kindlin-3，三者高度同源，約60%的氨基酸序列相同。Kindlins-2能被細胞外基質的整合素配體結合活化整合素信號通路，進而活化下游信號通路促進細胞黏附、擴散和遷移[16]。近年來研究表明，Kindlin-2能通過Kindlin-2/TGF-β/CSF-1信號軸，促進腫瘤相關巨噬細胞的活化，促進腫瘤細胞的增殖[17]。本研究中，前列腺癌組織中Kindlin-2表達上調，其原因可能是調控其表達的長鏈非編碼RNA(LncRNA)ATB升高后，作為分子海綿結合并促進Kindlin-2表達，促進腫瘤細胞的增殖及遷移能力，促進腫瘤的發展[18]。本研究中，Kindlin-2基因的表達與較高的Gleason評分和TNM分期有關，表明Kindlin-2參與前列腺癌的發生發展。其機制是Kindlin-2表達能直接促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，促進腫瘤浸潤及遠處轉移，促進腫瘤的惡性進展[19]。本研究中，Kindlin-2高表達患者生存預后較差，與以往研究報道一致[20]，表明Kindlin-2亦可能成為前列腺癌預后的分子標志。

本研究中，前列腺癌組織中SKP2與Kindlin-2表達呈正相關，目前兩者相互作用的機制尚不清楚，可能與兩者共同參與Wnt信號通路的調控有關。SKP2表達升高通過泛素化降解p27，促進β-鈣黏素進入細胞核，激活Wnt信號傳導通路[21]，而Kindlin-2表達亦能同時促進Wnt/β-catenin信號通路的活化[22]，二者協同促進下游靶基因如癌基因c-Myc、Smad7的表達，促進腫瘤的發生發展。

綜上所述，前列腺癌組織中SKP2及Kindlin-2均表達升高，二者聯合檢測有助于前列腺癌患者的病情判斷及預后評估。