膀胱癌組織中PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin的表達變化及意義

杜剛，黃瑛

(1中國醫科大學第二臨床學院，沈陽110004；2鞍鋼集團公司總醫院)

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一。最新報道顯示，目前我國膀胱癌總體發病率約為7.49/10萬，其中男性發病率約為11.41/10萬，女性發病率約為3.81/10萬，發病率呈逐年升高趨勢[1]。目前，膀胱癌的病因和發病機制仍未完全明確，相關研究表明，膀胱癌是一種多基因相關的惡性腫瘤，其發生發展與多種癌基因激活及抑癌基因失活有關[2]。脊髓灰質炎病毒受體相關基因4(PVRL4)是近年來新發現的一種癌基因，其表達產物具有調節上皮黏著連接形成的作用[3]。目前已有報道表明，在乳腺癌、肺癌中存在PVRL4高表達，但在膀胱癌中表達情況報道較少[4,5]。NF-κB信號通路是細胞內重要的信號調節通路，NF-κB p65是重要的轉錄調節因子，本課題組前期研究發現，NF-κB p65與膀胱炎有密切關系，可能對膀胱癌診斷和預后判定有一定價值[6]。E-鈣黏素(E-cadherin)是一種重要的黏附分子，與膀胱癌發生發展有關[7]。2017年3月～2018年10月，我們觀察了PVRL4、NF-κB和E-cadherin在膀胱癌組織中的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月～2018年4月大連醫科大學附屬第一醫院手術切除的46例份膀胱癌組織及其相應癌旁組織(距離腫瘤組織2 cm)石蠟標本。納入標準：①患者均經病理檢查確診為膀胱癌；②患者初次發病，病歷資料齊全；③術前未經放療、化療等；④患者及家屬對研究知情同意，并簽署知情同意書。其中男34例、女12例，年齡54～86(62.37±6.83)歲。單發17例，多發29例；腫瘤直徑：≤2 cm 32例，>2 cm 14例； 病理分級：Ⅰ級11例、Ⅱ級19例、Ⅲ級16例；臨床分級：Ta～T1 18例，T2～T4 28例。有淋巴結轉移11例，無淋巴結轉移35例。標本均經甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm厚連續切片，本研究經醫院倫理委員會研究同意。

1.2 膀胱癌組織及其癌旁組織中PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表達檢測 應用免疫組化SP法對膀胱癌組織及其癌旁組織中PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表達進行檢測，免疫組化SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，NF-κB p65和E-cadherin兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德有限公司，PVRL4兔抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司。石蠟切片經過脫蠟，梯度乙醇水化、PBS緩沖液沖洗、3%過氧化氫甲醇消化內源性過氧化物酶、高溫抗原修復、加入山羊血清進行封閉、滴加生物學一抗、生物學二抗、辣根過氧化物酶-鏈霉素工作液、TTBS沖洗、DAB顯色、蘇木素復染、制片封閉等。以說明書提供樣本作為陽性對照，以PBS代替生物學一抗作為陰性對照。參照文獻[8]方法對結果進行判定，采用雙盲法由兩名資深病理科醫生診斷。PVRL4 、NF-κB p65位于細胞質或細胞核內，當細胞質或細胞核內出現黃色或棕黃色顆粒為PVRL4 蛋白陽性；E-cadherin位于細胞質和細胞膜上，當細胞質和細胞膜出現黃色或棕黃色顆粒為E-cadherin陽性。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野倒置顯微鏡下(×400)觀察，根據染色強度和陽性細胞所占比例賦分：未著色(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)、黃褐色(3分)；無陽性細胞(0分)、陽性細胞所占比例1 % ～ 25 %(1分)、陽性細胞所占比例26 % ～ 50 %(2分)、陽性細胞所占比例51 % ～ 75 %(3分)、陽性細胞所占比例76 % ～ 100 %(4分)；總分=染色強度評分×陽性細胞所占比例率評分，總分≤ 6分計為陰性，> 6分計為陽性。

2 結果

2.1 膀胱癌組織和癌旁組織中PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表達比較 膀胱癌組織中 PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin陽性表達率分別為73.91%(34/46)、78.26%(36/46)、13.04%(6/46)，相應癌旁組織中PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin陽性表達率分別為15.22%(7/46)、26.09%(12/46)、63.04%(2/46)，膀胱癌組織中 PVRL4和NF-κB p65陽性表達率高于癌旁組織(P均<0.05)，E-cadherin陽性表達率低于癌旁組織(P<0.05)。

2.2 PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表達與膀胱癌患者臨床病理特征的關系 膀胱癌組織中PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin陽性表達率與患者性別、年齡、腫瘤數目、腫瘤直徑無關(P均﹥0.05)，與病理分級、臨床分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，隨病理分級、臨床分期升高，PVRL4、NF-κB p65陽性表達率升高，E-cadherin陽性表達率降低，有淋巴結轉移者PVRL4、NF-κB p65陽性表達率高于無淋巴結轉移者，E-cadherin陽性表達率低于無淋巴結轉移者(P<0.05)，見表1。

表1 PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表達與膀胱癌患者臨床病理特征的關系[例(%)]

2.3 膀胱癌組織中PVRL4、NF-κB p65和E-cadherin表達的相關性 Spearman相關分析顯示，PVRL4表達與膀胱癌病理分級、臨床分期、淋巴結轉移呈正相關(r分別為0.753、0.802、0.821，P均<0.05)；NF-κB p65表達與膀胱癌病理分級、臨床分期、淋巴結轉移呈正相關(r分別為0.761、0.813、0.832，P均<0.05)；E-cadherin表達與膀胱癌病理分級、臨床分期、淋巴結轉移呈負相關(r分別為-0.674、-0.756、-0.839，P均<0.05)。膀胱癌組織中PVRL4與NF-κB p65表達呈正相關(r分別為0.847、0.852、P均<0.05)，與E-cadherin表達呈負相關(r=-0.759,P<0.05)。

3 討論

大量臨床研究表明，膀胱癌的發生發展過程復雜，涉及到：①抑癌基因突變及缺失；②癌基因激活及過度表達；③細胞端粒酶過度表達；④調控信號傳導通路的功能紊亂；⑤在基因組中出現核苷酸異常的串聯重復，微衛星不穩定；⑥與修復功能相關的基因功能喪失。研究膀胱癌基因的表達對于提高膀胱癌的臨床診斷，尋找分子靶向治療的新方法有重要意義。

PVRL4是近年來新發現的一種癌基因，其編碼的PVRL4蛋白是一個含有510個氨基酸的跨膜蛋白，相對分子質量為66 kD[9]。研究表明，PVRL4蛋白屬于免疫球蛋白超家族Nectin的成員，與細胞增殖、黏附和遷移等有密切關系[10]。Raza等[11]研究報道，PVRL4蛋白主要在人胚胎發育階段和腫瘤組織中表達，而在正常成人組織中不表達。近年來有學者發現，PVRL4是肺癌、乳腺癌和卵巢癌的腫瘤細胞標志物蛋白[12,13]。NF-κB是一個轉錄因子家族，主要包括Rel、RelB 、NF-κB p50、NF-κB p52、NF-κB p65 5個成員，生理狀態下NF-κB主要以p65/p50異源二聚體的形式存在于細胞內，并與其抑制蛋白相結合，在細胞質內處于非活性狀態[14]。當機體處于應激、炎癥、創傷和腫瘤時，NF-κB抑制蛋白被磷酸化，使p65/p50異源二聚體解離，并與相應的位點特異性結合，啟動信號通路，發揮相應的功能。宮雪等[15]報道，NF-κB p65在膀胱癌組織中高表達，具有促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的作用。E-cadherin蛋白是鈣黏素家族的重要成員，是由720～750個氨基酸構成的單鏈I型跨膜糖蛋白[16]。E-cadherin蛋白主要位于細胞連接處的細胞表面，在維持細胞間黏附、細胞極性及正常組織結構中起到重要作用。目前研究表明，E-cadherin表達下調可致細胞間連接改變，與上皮來源的惡性腫瘤發生有密切關系[17]。

本研究結果顯示，膀胱癌組織中PVRL4和NF-κB p65陽性表達率高于癌旁組織，差異有統計學意義，E-cadherin陽性表達率低于癌旁組織，差異有統計學意義，與毛沖舟等[18]報道相符，證實在膀胱癌組織中存在PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin異常表達，表明PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin與膀胱癌的發生有密切關系。進一步分析發現，PVRL4、NF-κB p65表達與膀胱癌患者病理分級、臨床分期、淋巴結轉移呈正相關，E-cadherin表達與膀胱癌患者病理分級、臨床分期、淋巴結轉移呈負相關。推測其原因主要是：①PVRL4表達異常使膀胱上皮細胞失去穩定性，促進膀胱癌的發生[19]；②在各種致瘤因素下，p65/p50異源二聚體解離，NF-κB p65表達升高，NF-κB信號異常激活，促進腫瘤的進一步發展[20]；③E-cadherin表達下調導致細胞間連接降低，膀胱上皮細胞發生癌變，促進癌細胞轉移[21]。可見，臨床可通過檢測PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin表達來為膀胱癌診斷、疾病評估和預后判斷提供輔助依據。

目前，對膀胱癌發生相關的分子機制仍未完全明確。本研究結果顯示，膀胱癌中PVRL4與NF-κB p65表達呈正相關，與E-cadherin表達呈負相關。其中NF-κB p65是NF-κB信號通路的重要成員，而E-cadherin亦是NF-κB信號通路中的重要效應分子。有研究顯示，NF-κB信號通路可調控E-cadherin，導致E-cadherin水平降低[22]。PVRL4與細胞增殖、黏附和遷移等密切相關。筆者推測PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin可能共同參與膀胱癌的發生發展，其確切機制有待進一步研究證實。

綜上所述，膀胱癌組織中PVRL4、NF-κB p65呈高表達，E-cadherin呈低表達，PVRL4、NF-κB p65、E-cadherin與膀胱癌患者病理分級、臨床分期、淋巴結轉移有關；三者可能共同參與膀胱癌的發生發展。