甲狀腺癌組織中miR-146a、LIN52 mRNA的表達變化及意義

周偉清,沈衛星,莊一心

(復旦大學附屬中山醫院青浦分院， 上海 201700)

甲狀腺癌是內分泌系統及頭頸部常見的惡性腫瘤，在女性中發病較高，發病數占全部腫瘤的1%，流行病學研究表明，近30年來，全球多數地區甲狀腺癌的發病呈上升趨勢[1]。目前，甲狀腺癌的治療主要以手術治療為主，術后治療包括甲狀腺素抑制治療、放射性碘治療，近年來分子靶向治療及免疫治療亦得到快速發展。甲狀腺的治療及預后評估需根據患者的具體表現選擇合適的干預方法，若借用分子生物學、表觀遺傳學來對甲狀腺癌的全面評估可提高疾病的治療成功率、改善患者預后[2]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼的小分子RNA，長度約為22個核苷酸，廣泛存在于各種生物中，調控人體60%蛋白質編碼基因的轉錄翻譯過程[3]。同時miRNA可參與調控腫瘤的發生發展[4]。有研究證實，諸多miRNA基因簇或單個miRNA在甲狀腺癌中表達異常[5]。有研究發現，在乳頭狀甲狀腺癌中，miR-146a表達顯著升高，且miR-146a表達與腫瘤侵襲力呈顯著相關性，故miR-146a可作為預后不良的觀察指標之一[5]。LIN52是一種轉錄因子配對盒，研究發現，其可在轉錄水平調控一系列生理活動[6]，有研究表明LIN52可能是miR-146a的調控基因之一，參與miR-146a的表達過程中[7]。2014年10月～2019年5月，我們觀察了甲狀腺癌組織中miR-146a、LIN52 mRNA的表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年10月～2016年5月于我院確診為甲狀腺癌患者90例。納入標準：①經病理學檢查確診患者為甲狀腺癌；②患者既往經手術治療，但未在手術前接受化療、放療等治療；③臨床病理及隨訪資料完整；④患者一般身體狀況良好，Kamofsky評分≥80分。排除標準：①近3個月有創傷、手術史；②合并甲狀腺功能能亢進、庫欣綜合征等內分泌系統疾病；③合并其他器官或系統的惡性腫瘤；④伴有嚴重的肝腎功能障礙。90例患者中男35例、女55例，年齡41～68(58.5±9.2)歲。伴有淋巴結轉移者40例；伴有局部浸潤者36例；TNM分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期25例，Ⅲ期42例，Ⅳ期8例。病理類型：乳頭狀癌67例，濾泡癌13例，甲狀腺髓樣癌7例，未分化型甲狀腺癌3例。患者自愿參加本項研究，并知情同意自愿提供癌組織切片、癌旁組織切片用于研究中數據采集等工作。所有患者自出院之日起開始進行生存期隨訪，每1～3個月隨訪1次，以門診或電話方式隨訪，中位隨訪時間32個月，隨訪截止到2019年5月。

1.2 癌及癌旁組織中miR-146a及LIN52表達測定 收集患者經甲狀腺全切除或次全切除術后腫瘤組織切片及距腫瘤組織切緣>2 cm的癌旁正常組織切片0.05 g，加入TRIzol 1 mL研碎成漿提取RNA后，于紫外分光光度計波長260、280 nm處檢測樣品吸光度值，計算樣品的RNA純度和濃度，并進行相應稀釋。隨后利用逆轉錄試劑盒中反轉錄酶來進行體外互補DNA(cDNA)合成過程。以合成的cDNA為模板，按如下反應條件和反應體積檢測miRNA-146a 和LIN52 mRNA相對表達。反應條件：DNA變性，95 ℃ 30 s；引物退火：60 ℃ 30 s，引物延伸72 ℃ 4 min；進行40 個循環。20 μL PCR 反應總體積包括：10 μL 2×SYBR Premix ExTaq，0.5 μL正反向引物，1 μL cDNA 模板和8 μL ddH2O。每份樣品均檢測3 次，以U6 為內參，使用2-△△Ct法計算甲狀腺癌及癌旁組織中miRNA-146a、LIN52的相對表達量。U6 正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miRNA- 146a 正向引物：5′-TGTTGCTGAAGAGCTCTGGTAC-3′，反向引物：5′-TCGTCTGATGATGTCGAATGTAC-3′；LIN52正向引物：5′-GTTTACCTGAAGAGCTCTGGTAC-3′，反向引物：5′-CCTTATCTGCTAGTGTCGACATCAT-3′。

2 結果

2.1 甲狀腺癌及癌旁組織中miRNA-146a、LIN52 mRNA 表達比較 甲狀腺癌患者癌及癌旁組織中miR-146a相對表達量分別為1.22±0.26、0.65±0.11，二者比較差異有統計學意義(t=19.154，P<0.05)。甲狀腺癌患者癌及癌旁組織中LIN52 mRNA相對表達量分別為0.68±0.17、1.48±0.30，二者比較差異有統計學意義(t=15.570，P<0.05)。

2.2 miRNA-146a及LIN52 mRNA表達與癌癥患者臨床病理特征的關系 癌組織中miRNA-146a及LIN52 mRNA相對表達量與淋巴結轉移、TNM分期、局部浸潤有關(P均<0.05)，與患者的性別、年齡、病理類型無關(P均>0.05)。見表1。

2.3 癌組織中miR-146a與LIN52表達的關系 癌組織中miR-146a與LIN52表達呈負相關(r=-0.611,P=0.009)。

2.4 miR-146a、LIN52 mRNA表達與甲狀腺癌患者預后的關系 患者獲隨訪1～36個月，中位隨訪時間32個月，無失訪病例，死亡25例。以甲狀腺癌組織中miR-146a mRNA相對表達量的平均數0.65為臨界值，分為miR-146a高表達組43例，miR-146a低表達組47例。miR-146a高表達組3年生存率為86.05%(37/43)，miR-146a低表達組3年生存率為59.57%(28/47)，miR-146a高表達組的3年生存率高于miR-146a低表達組(χ2=7.844，P=0.005)。以LIN52 mRNA相對表達量的平均數1.48為臨界值，分為LIN52高表達組46例和LIN52低表達組44例。LIN52高表達組3年生存率為60.87%(28/46)，LIN52低表達組3年生存率為84.09%(37/44)，LIN52高表達組3年生存率低于LIN52低表達組(χ2=6.045，P=0.014)。

表1 miR-146a、LIN52表達與甲狀腺癌患者臨床病理特征的關系

3 討論

甲狀腺癌即使根治性手術后仍有較高的復發風險，預后較差。腫瘤的發生發展伴有癌基因的激活和抑癌基因的失活，進而導致絲裂原激活的蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶等多條信號傳導通路的活化，導致下游靶基因，如血管內皮生長因子等的過表達，促進腫瘤細胞增殖及血管生成等生物學過程，促進腫瘤的發生發展。以往認為非編碼RNA(ncRNA)是轉錄過程中的“分子垃圾”，而近年來發現，ncRNA能通過影響基因的轉錄、翻譯、翻譯后修飾等基因表達的各個階段，調控細胞的增殖、分化、衰老及自噬等生物學行為[8]。

miRNA具有19～25個堿基的ncRNA，可與mRNA 3′端非編碼區(3′UTR)相結合來調控多種基因的mRNA表達。miRNA基因通常由RNA聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ)進行轉錄，初步產物為具有帽子結構和多聚腺苷酸尾巴的初級轉錄miRNA(pri-miRNA)，隨后pri-miRNA在細胞質中被核酸內切酶(Dicer)進一步切割，產生成熟miRNA。多種miRNA在腫瘤中均存在表達異常(升高或降低)的現象，形成復雜的RNA調控網絡，參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、浸潤、轉移及血管生成等生物學過程[9,10]。miR-146a是miR-146家族中的一員，人類miR-146a基因定位于第五號染色體LOC285628基因的第二個外顯子區 (Chr.5q34)上[11]。研究表明，miR-146a能結合鋅離子相關RhoA蛋白1(ROCK1)、乳腺癌轉移抑制基因1(BRMS1)等多種靶基因的信使RNA，在轉錄后水平調控原癌基因表達[12,13]，而在前列腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌、口腔癌等多種腫瘤組織中miR-146a表達降低[14,15]，導致ROCK1等癌基因的過度活化。本研究結果發現，甲狀腺癌組織中miR-146a 相對表達量低于癌旁組織，差異有統計學意義，可能原因是在腫瘤生長中發生甲基化、乙酰化導致基因表達下降有關，趨化DNA甲基轉移酶1通過發揮DNA甲基化的作用，增加miR-146a甲基化以抑制其基因表達，從而促進腫瘤的發生發展[16]。甲狀腺癌組織中miR-146a相對表達量與患者淋巴結轉移、TNM分期、局部浸潤有關。表明miR-146a影響甲狀腺癌的發生發展，miR-146a表達降低后，導致PI3K-AKT-mTOR 信號通路激活，通過下游癌基因促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡，導致腫瘤分期升高。此外，基質金屬蛋白酶等因子表達增加，促進細胞外基質降解，導致腫瘤細胞的局部浸潤增加，而血管內皮生長因子促進淋巴管新生，腫瘤易發生淋巴結轉移[17]。miR-146a高表達組3年生存率高于miR-146a低表達組，表明miR-146a是影響患者預后的關鍵因素之一，可作為不良預后的生物標志物。

LIN52基因屬于合成多樣性(synMuv)家族成員之一，synMuv 家族包括A類和B類基因，A類包括LIN-8、LIN-15A、LIN-38和LIN-56，而B類包括LIN-9、LIN-15B、LIN-35、LIN-36、LIN- 37、LIN-51、LIN-52、LIN-53、LIN-54和LIN-55。研究表明，synMuv家族成員能編碼產生相應蛋白，激活受體酪氨酸激酶/RAS信號通路的信號傳導，通過促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡等機制，促進腫瘤的進展[18]。本研究結果表明，甲狀腺癌患者癌組織中LIN52 mRNA相對表達量高于癌旁組織，其機制可能與miRNA對LIN52的轉錄后調控有關。有研究表明，miR-146a能結合LIN52信使RNA的3′UTR，并降低LIN52信使RNA的穩定性，抑制其表達，而腫瘤發生時miR-146a表達降低，導致LIN52表達升高[19]。本研究中，甲狀腺癌組織中miR-146a與LIN52表達呈負相關，可能與miR-146a對LIN52信使RNA表達的調控作用有關[20]。此外，本研究發現患者LIN52表達與淋巴結轉移、TNM分期、局部浸潤有關。其原因一方面是LIN52的表達影響細胞周期激酶的活性，減少G0/G1期阻滯，促進腫瘤細胞的增殖，導致腫瘤TNM分期升高[21]。另一方面，腫瘤細胞LIN52表達升高時，可通過抑制轉錄因子E2F的表達，促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，導致上皮性表型E鈣黏素表達減少，腫瘤細胞易發生局部浸潤和淋巴轉移[22,23]。本研究中，LIN52高表達組3年生存率低于LIN52低表達組，差異有統計學意義，說明LIN52在腫瘤生長過程中發揮促癌作用，LIN52低表達的患者可以獲得良好預后。

綜上所述，甲狀腺癌組織中miR-146a表達降低，LIN52表達升高，兩者的表達與腫瘤轉移、腫瘤分期、浸潤程度有關；miR-146a和LIN52參與甲狀腺癌的發生發展，有望成為甲狀腺癌預后新的生物學靶點。