口腔黏膜良性淋巴組織增生病中肥大細胞與微血管的相關性研究

張 昊 敦鈴霞 謝以婷 李荷香 宋 鵬 劉慧娟 侯亞麗

口腔黏膜良性淋巴組織增生病（benign lymphoadenosis of oral mucosa，BLOM）是一種慢性炎癥性口腔黏膜病，但由于其誤診率高，其病因和發病機制至今不甚清楚，治療效果不佳。因此，探討其發病機制，尋找新的治療靶點勢在必行。目前，越來越多的證據[1]表明肥大細胞（mast cell，MC）對炎癥性疾病的發病機制至關重要。而血管生成現象又是慢性炎癥過程發病機制的基礎。那么BLOM 中肥大細胞密度（mast cell density，MCD）和微血管密度（microvessel density，MVD）的關系如何？目前國內鮮有報道。因此，本研究采用免疫組織化學方法檢測BLOM 中MCD 和MVD，探討其相關性，為研究BLOM 發病機制，尋找新的治療靶點提供線索。

資料和方法

一、材料

1.研究對象：30 例BLOM 蠟塊均來自河北醫科大學口腔醫院病理科作為BLOM 組。15 例正常黏膜組織取自腫瘤周圍正常黏膜作為正常對照組。30 例BLOM 患者均無移植物抗宿主疾病、丙型肝炎或艾滋病毒感染；活檢前近六個月均沒有接受過局部或全身治療。

2.試劑：肥大細胞類胰蛋白酶單克隆抗體購自英國Abcam 公司、CD105 單克隆抗體、PV-9000 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋。

二、實驗方法

1.免疫組織化學染色法：將BLOM 組和正常對照組蠟塊分別切成厚度為3～4 微米的切片，常規脫蠟至水，0.01MPBS 沖洗5min×3 次，放入枸櫞酸緩沖液中熱修復，一抗類胰蛋白酶抗體滴度為1:1000，CD105 抗體滴度為1:100，以后按PV9000 試劑盒說明書操作，蘇木素復染，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對照采用已知的陽性組織切片，陰性對照用PBS 代替一抗。

2.MCD 和MVD 計數：分別將BLOM 組和正常對照組每張切片在低倍鏡（×40）下選取肥大細胞類胰蛋白酶和CD105 染色最密集的部位，高倍鏡（×400）下計數。凡胞漿呈現棕黃色或黃褐色的為陽性肥大細胞。胞漿呈現棕黃色或棕褐色的單個血管內皮細胞或細胞簇（小于3～5 個血管內皮細胞），與鄰近結締組織界限明顯者計為一個獨立的微血管。每張切片計數3 個高倍視野下肥大細胞數量和微血管數目，取其均值，分別作為MCD 和MVD 值。MCD 和MVD 計數由2 名病理科醫師采用雙盲法完成。

三、統計學處理

采用SPSS17.0 對數據進行統計學分析。計量資料采用平均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 有統計學意義。相關性分析采用Spearman 檢驗，以P＜0.05 為有統計學意義。

結果

1.一般情況：30 例BLOM 中，男性11 例（36.67%），平均年齡56.2727±16.10025 歲，女性19 例（63.33%），平均年齡，53.5789±10.93575 歲。病程0.5～240 個月不等。15 例正常黏膜組織取自腫瘤周圍正常黏膜作為正常對照組。其中男性7 例（46.67%），平均年齡58.8571±10.33487 歲、女性8 例（53.33%），平均年齡56.3750±8.38259 歲。

表1 BLOM 組和正常對照組MCD 和MVD 的關系

2.結果（表1）。

BLOM 組和正常對照組均有類胰蛋白酶陽性的MC（圖1～2），30 例BLOM 中MCD 范圍21～195.67，均值55.0183±34.45887；正常對照組MCD 范圍13～35.67，均值19.9554±5.29479。兩組比較，差異有明顯統計學意義（P＜0.05）。

圖1 MC 在BLOM 組的表達（免疫組織化學染色 ×200）

圖2 MC 在正常對照組的表達（免疫組織化學染色 ×200）

圖3 CD105 在BLOM 的表達（免疫組織化學×200）

圖4 CD105 在正常對照組的表達（免疫組織化學染色 ×200）

CD105 陽性MVD 在BLOM 組為陽性表達（圖3），在正常對照組幾乎為陰性（圖4）。BLOM 中MVD范圍9.33～29，均值19.8850±6.21789；正常對照組MVD 范圍0～2，均值1.0000±0.80178。兩組比較，差異有明顯統計學意義（P＜0.05）。

Spearman 等級相關分析顯示BLOM 組MCD 與MVD 呈正相關（r＝0.619，P＜0.01）。

討論

BLOM 是一種臨床并不少見的口腔黏膜病，但由于其復雜的臨床表現和高誤診率，治療效果不佳，易反復復發出現癌變。

MC 來源于骨髓造血干細胞，是一種結締組織的主要效應細胞，在炎癥過程中起著關鍵作用。研究已表明多種口腔炎癥性疾病如口腔扁平苔蘚[2]，牙周炎[3]，根尖周囊腫[3]中都發現有MC 浸潤的增高。MC 胞漿中含有異染顆粒，其中類胰蛋白酶是含量最多的介質。BLOM 病理特征是在不同程度淋巴細胞、漿細胞和粒細胞浸潤背景上有淋巴濾泡形成或淋巴細胞灶狀聚集，這說明BLOM 是一種慢性炎癥性口腔黏膜病。Scardina 等[4]認為血管生成現象是慢性炎癥過程發病機制的基礎。目前，大多數研究者常采用CD31、CD34 和血管內皮生長因子（VEGF）等廣泛內皮細胞標記物檢測MVD[5]。但是這些泛血管內皮細胞標志物對新生血管缺乏特異性，對組織中所有內皮細胞均有表達，而CD105 僅對活化的新生血管內皮細胞表達。因此，CD105 被研究者認為是一種新生血管的特異標記物[6，7]。本研究結果顯示，BLOM 中MCD 較對正常照組明顯升高，與平昭等研究結果相似。CD105 標記的MVD 在正常對照組陰性表達，在BLOM 組陽性表達，兩組相比較，CD105-MVD 數目有顯著性差異，這說明BLOM 中存在明顯的血管生成現象，與李曙霞[8]等研究結果一致。Sheelam S[9]等認為血管生成會導致更多淋巴細胞的募集和保留，從而加重炎癥，使疾病進展或病變復發，導致癌變。因此，靶向血管形成的各種分子和途徑的治療可以更好地控制潛在惡性疾病的進展。有研究[10]表明血管生成在口腔黏膜白斑惡性轉變的早期階段就已經開啟。但是否也在BLOM 癌變的早期階段開啟了血管的生成，有待進一步研究。本研究結果還顯示BLOM 組MCD 和MVD 存在正相關性，進一步說明了MC 參與了BLOM 中血管的新生，為尋找BLOM 新的治療靶點提供了線索。BLOM 是某種刺激因素導致的淋巴組織的反應性增生性疾病。細菌、病毒或者某種刺激可能在一定條件下激活MC，使MC 脫顆粒，分泌肝素、組胺、血管內皮生長因子和類胰蛋白酶等多種促血管生成因子[3]誘導微血管內皮細胞增殖。MC 在脫顆粒的的同時，也可以合成并分泌TNF-α，而TNF-α 能夠上調C-C 趨化因子受體1 型和RANTES 表達[11]，從而觸發MC 進一步脫顆粒，釋放促血管生成因子，引起白細胞遷移、加重炎癥和導致血管新生。