微小RNA和膽固醇穩態研究綜述

孫煥平，王 凱

1 前言

膽固醇作為兩類最主要的細胞脂質物質之一，是真核細胞細胞膜的重要結構成分。它是類固醇激素和膽汁酸的前體，是一種天然的生物活性劑，能夠作為信號分子參與多種細胞功能[1]。由于膽固醇對細胞的基本功能，當維持膽固醇穩態的調節網絡受到干擾會導致機體產生嚴重臨床病癥，如動脈粥樣硬化、肥胖癥和糖尿病等[2]。因此，機體調節網絡機制能夠平衡細胞內和細胞膜水平的膽固醇水平，以適應生理變化的需要。機體通過甾醇生物合成，脂蛋白攝取，脂肪分解動員固醇和內流及外流的反饋調節，在轉錄和轉錄后水平維持膽固醇穩態[3]。固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs)是膽固醇穩態轉錄通路中關鍵的調節因子。SREBP有三種主要亞型；SREBP-1a和SREBP-1c來自SREBP1基因中染色體11上的兩個獨立啟動子，可產生獨特的5′非編碼區(5′UTR)氨基末端mRNA；SREBP-2來自SREBP2基因中染色體15上。SREBPs協調調控膽固醇和脂肪酸的生物合成，研究表明，SREBP-1c作為一種相對較弱的轉錄激活因子優先參與脂肪酸代謝基因的激活，而SREBP-1a激活膽固醇和脂肪酸代謝基因；SREBP-2優先激活膽固醇代謝的基因。

不同的SREBP亞型在轉錄水平上，通過不同的組織特異性信號傳導途徑進行獨立調節，使內質網膜上大約1100種氨基酸前體被表達。當細胞固醇水平較低時，內質網膜相關的SREBP前體形成復雜的SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein，SCAP)，并被轉運至高爾基體使氨基末端成熟的SREBP在其膜上被水解釋放。這些活性轉錄因子被轉運至細胞核，誘導核內與膽固醇生物合成，脂蛋白攝取和脂肪分解相關的基因轉錄[4]。有研究表明，膽固醇水平能調控SREBP從內質網至高爾基體的轉運，多不飽和脂肪酸等其他信號也能調節SREBP-1同系物的成熟[3]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一組內源性的，由20-25個核苷酸非編碼組成的RNA，其能夠通過與自身目標mRNA的3′非編碼區(3′UTR)不完全堿基配對，來誘導靶基因的降解或是翻譯抑制，從而完成對蛋白質合成的調節[4]。另有研究表明，miRNA也可以通過與其他區域(包括5′UTR或蛋白質編碼的外顯子)結合抑制mRNA的靶標[5]。此外研究發現，單獨miRNA不僅可以在mRNA的3′UTR中配對多個靶點位，而且單獨mRNA也可被多個不同miRNA共同靶標，這表明miRNAs利用協同作用調控基因表達[6]。現已證實miRNA調節膽固醇穩態的關鍵因子，涉及miRNA表達水平的改變與膽固醇代謝紊亂高度相關[2]。位于SREBP內含子中的miRNA有助于維持體內膽固醇平衡，影響高密度脂蛋白(HDL)生命周期[6]，改善脂肪酸代謝和胰島素信號釋放[7]。因此，miRNAs轉錄后調控作用除了激活復雜的轉錄因子外，還是維持細胞內膽固醇代謝調節網絡穩定的關鍵。

2 miRNA的生物合成及轉錄

miRNA在哺乳動物的生物合成中，大多數miRNA基因被RNA聚合酶II(RNA Pol II)轉錄生成長鏈的初級miRNA轉錄物(pri-miRNA)，隨后被加帽聚腺苷酸化并剪接產生pre-miRNA[7]。另有一些miRNA也被RNA酶III(Pol III)轉錄[8]。然后核糖核酸酶Ⅲ(RNase-Ⅲ)Drosha瞬間將pri-miRNA中間體切割成包含約70-90個核苷酸的莖環狀pre-miRNA。緊接著由Ran-GTP 依賴性核轉運受體 Exportin5將pre-miRNA運送至細胞質，并由細胞質中Dicer酶進一步處理以產生成熟的miRNA，其長度約為22個核苷酸。成熟的miRNA與Argonaute家族蛋白(AGO)結合形成RNA誘導沉默復合物(RISC)，RISC通過不完全堿基配對使mRNA的3'UTR與miRNA的“種子”區域特異性結合，最后增強mRNA翻轉和/或轉錄抑制[9]。

miRNA表達受到組織特異性和發育階段異性控制。大多數miRNA基因轉錄是由RNA Pol II介導的，他們的啟動子在蛋白質基因編碼中被認為具有序列特征和轉錄調控機制[10]。事實上，高通量測序和生物信息學方法已經揭示，miRNA基因近端上游區域具有TATA盒、啟動子元素、TFIIB識別元素(TFIIB recognition element，BRE)和大量轉錄因子結合基序[11]。此外，最近的研究已經預測miRNA啟動子區域接近轉錄起始位點，暗示表觀遺傳機制，如DNA甲基化和組蛋白修飾對miRNA表達調控的作用[12]。為了更好地理解miRNA基因的多樣性、功能和生物合成，需要關于替代、剪接啟動子和miRNA基因加工的更詳細信息。

3 miRNA在膽固醇生物合成中的作用

3.1 膽固醇平衡調節回路：SREBP和miRNAs

研究表明，miRNA 能夠直接或者間接影響相關轉運蛋白和催化酶的活性，參與膽固醇合成、運輸，在機體膽固醇穩態維持過程中發揮關鍵性作用[8，9]。

SREBP-1a和SREBP-1c參與脂肪酸和葡萄糖等能量代謝相關基因表達，而SREBP-2更具特異性的參與膽固醇代謝基因的轉錄調控[3]。膽固醇調節元件結合蛋白裂解激活蛋白(sterol regulatory element binding proteins cleavage-activating protein,SCAP)是主要的膜上膽固醇傳感器，內質網中不活躍的SREBP前體能夠直接與SCAP交互作用。當內質網膜閾值水平高于5mol/%時，SCAP直接結合膽固醇，并維持與胰島素誘導基因(insulin induced gene，INSIG)結合的構象，促使SREBP進入內質網中。然而，當內質網膜膽固醇低于5%時，SCAP構象發生改變，不再與INSIG相互作用。這使得SCAP與外被蛋白(coat protein Ⅱ，COP II)相互作用，將SCAP-SREBP復合物運送至高爾基體。進入高爾基體后，SREBP經過位點1和位點2蛋白酶協同一致的兩步蛋白水解作用，釋放代表成熟轉錄因子的氨基區域并遷移至細胞核，激活SREBP靶基因的表達。細胞核內SREBPs是不穩定的，并能被泛素-蛋白酶體系統通過靶向E3泛素連接酶F-box和F 框/WD-40 域蛋白 7(F-box and WD repeat domain-containing 7,Fbxw7)降解[4]。最近研究發現，小鼠和人類肝臟組織中miR-183、miR-96、miR-182操縱子被SREBP-2直接激活。SREBP-2與TSS附近的miR-183/96/182轉錄單元的保守結合位點相互作用，促進三個miRNA的多順反子轉錄。miR-182靶向FBXW7，miR-96靶向INSIG2，建立調節SREBP活性的正反饋回路，從而維持膽固醇穩定[13, 14]。

另有研究表明，miR-24靶向INSIG1也會對SREBP水平產生積極影響[15]，但miR-24如何調控體內SREBP平衡機制還有待確定。盡管如此，在飲食誘導的肥胖小鼠中拮抗miR-24仍能通過下調脂質基因表達，顯著降低血漿和肝臟脂質水平。在非酒精性脂肪肝或脂肪性肝炎患者中也觀察到高水平的miR-24以及更低水平的INSIGI[16]，說明miR-24和INSIGI之間的作用可能參與調控代謝性疾病中脂質平衡。

miR-185表達受SREBP-1c調控， SREBP-1c與miR-185的啟動子區域內特定基序結合。在這種情況下，通過體內和體外靶向SREBP-2的3′UTR導致膽固醇代謝基因功能失活，例如羥基-3-甲基戊二酰基-CoA還原酶(HMGCR)和低密度脂蛋白受體(LDLR)的表達降低。脂肪酸是膽固醇酯合成原料，而SREBP-1c主要調節脂肪酸的產生。這表明SREBP-1c/miR-185軸構成膽固醇代謝反饋通路，維持有力膽固醇和膽固醇酯的比值[17]。需要進一步的研究來了解miR-185在代謝性疾病中的生理作用。

3.2 膽固醇生物合成中的其他miRNA

在研究中抑制肝臟miR-122表達，導致小鼠血漿和肝臟的膽固醇和甘油三酯水平降低，表明miR-122對脂質和脂肪酸氧化基因有重要影響。后續研究還顯示，減少miR-122可降低非人類靈長類游離膽固醇水平[18]。因此，miR-122被認為是潛在的新型降脂劑，提示它可能是一種治療靶點。然而，另一項研究顯示，在NASH患者中miR-122表達顯著下調，抑制miR-122促進了人肝臟細胞中脂肪酸和膽固醇合成基因的表達[19]。這些相互矛盾的研究很可能是由于miR-122是肝臟中表達最高的miRNA之一，能夠通過多種途徑對正常肝功能產生重要影響。

NASH患者肝臟中miR-34a水平升高，這與SREBP-2增加有關[20]。研究發現，miR-34a可通過抑制SIRT1基因使SREBP-2穩定[21]。Lee等人發現，法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor，FXR)通過激活轉錄抑制因子抑制miR-34a的表達，發揮調節SIRT1的功能。在非酒精性脂肪肝病中miR-34a和p53升高與SIRT1被抑制相關[22]。熊去氧膽酸是一種天然的膽汁酸，可通過激活膽汁酸受體FXR來降低脂毒性和NAFLD，Castro等人報道稱這可能是FXR對miR-34a/SIRT1/p53軸的影響[23]。因此，miR-34a的上調可能促進肝臟脂肪變性的發生和進展，這表明抗miR-34a化合物能夠有效治療NAFLD和NASH。

最近研究顯示，細胞膽固醇水平能夠增加miR-223轉錄水平。在人肝細胞系中過表達的miR-223通過降低清道夫受體(SR-BI)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a合酶(HMGCS1)活性，抑制膽固醇吸收和生物合成，并通過促進ABCA1基因表達提高膽固醇外流。此外，miR-223敲除小鼠通過誘導膽固醇生物合成基因(包括HMGCS1[24])，其血漿和肝臟表現出較高的膽固醇水平。這些結果表明，miR-223在調節全身膽固醇穩態中起關鍵作用。

4 miRNA對膽固醇逆轉運的調節

4.1 膽固醇外流與miRNA

除了生物合成外，調控過量膽固醇外流對維持膽固醇穩態也是至關重要的。膽固醇轉運體，ATP結合盒轉運體A1 (ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)促進膽固醇外流至細胞外受體，形成新生的高密度脂蛋白(HDL)顆粒。這個過程是膽固醇逆轉運(RCT)的第一步，多余的膽固醇從外周細胞轉運至肝臟，以便外排到膽汁和糞便中[25]。肝臟ABCA1失活會導致小鼠體內總HDL-c嚴重減少[26]。由于血漿HDL-C水平與心血管疾病呈負相關，因此ABCA1介導的膽固醇流出對于維持膽固醇動態平衡和防止動脈粥樣硬化至關重要。最近的研究表明，幾種miRNA靶向ABCA1，從而調節血漿HDL-C水平。其中，位于SREBP-2基因內含子內的miR-33a研究最為廣泛。miR-33a和SREBP-2由于共同表達，協同調控膽固醇合成吸收和轉運，以維持細胞膽固醇穩態[27]。此外，抑制miR-33能夠顯著增加肝臟ABCA1表達，進而增加小鼠體內循環HDL-c水平[28]。miR-33a在物種間高度保守，而人類位于SREBP1基因內含子中的miR-33b在嚙齒動物中不存在。由于胰島素抵抗引起的高胰島素血癥持續誘導SREBP-1c表達，人體在這種條件下miR-33b顯著增加。這說明脂質生物合成調節異常和膽固醇流出可能導致高脂血癥和心血管疾病。事實上，在胰島素抵抗的非人類靈長類動物中miR-33b和SREBP-1c都顯著增加[29]，通過miR-33拮抗作用調控miR-33靶基因(如ABCA1)，能夠顯著減低VLDL并增加HDL。盡管拮抗劑對葡萄糖穩態或胰島素敏感性的作用尚未觀察到，但這些結果表明miR-33a / b靶向治療人類代謝疾病的治療潛力。

肝X受體(Liver X receptor，LXR)是膽固醇代謝的主要調控因子，能夠激活ABCA1、ABCG1等多種參與膽固醇逆轉運的基因[30]。最近的一項研究證明了這點，在巨噬細胞中miR-26被氧化甾醇激活，能夠靶向調控ABCA1和細胞內膽固醇轉運蛋白[31]。相反，在類似的條件下，miR-144被LXR上調，并靶向ABCA1，表明在膽固醇流出過程中存在負反饋調節[32]。通過靶向LXR的3'UTR，肝臟miR-613參與LXR自動的反饋調節循環。此外，激活核受體FXR能夠促進miR-144表達，同時控制膽汁酸合成、排出和運輸的基因。miR-144還抑制肝臟ABCA1并降低血漿HDL-C水平。使用FXR激動劑可增加肝臟SR-BI的表達，促進肝臟對HDL-c的吸收，提示FXR誘導的miR-144是RCT過程中將膽固醇轉化為膽汁的有效補充途徑[33]。

4.2 HDL-c吸收與miRNA

肝臟和類固醇生成組織中SR-BI高度表達，能夠促使HDL-c釋放出膽固醇用于類固醇激素合成[34]。盡管血漿中低HDL-c水平是動脈粥樣硬化的標志，但是提高HDL-c的益處仍存在爭議。即便是在血漿HDL-c水平極低的情況下，小鼠肝臟SR-BI過表達同樣能夠降低動脈粥樣硬化程度。功能性獲得肝SR-BI可以選擇性增加HDL-c吸收，并增加殘留HDL顆粒的水平，這可能更有效的促進巨噬細胞中膽固醇外流，從而增加膽固醇外排至膽汁以及巨噬細胞膽固醇流出的總體速率。另一方面，敲除小鼠SR-BI基因導致肝臟分解HDL-c的代謝受損，HDL-c水平顯著升高，巨噬細胞RCT速率降低，小鼠更易受APOE- 或LDLR-缺陷引發的動脈粥樣硬化影響。這些結果表明，肝臟SR-BI可以影響RCT的總體速率，并且其表達的調控對于維持膽固醇穩態具有重要意義。最近研究表明，人肝細胞系中miR-185、miR-96和miR-223都能夠抑制SR-BI和HDL-C攝取。在高脂飲食喂養APOE敲除小鼠中，其肝臟miR-96和miR-185表達顯著下調，而SR-BI表達增加，提示這兩種miRNA都可能調節血漿HDL-C水平和RCT[35]。此外，在高膽固醇喂養的小鼠肝臟中miR-96也顯著下調，從而抑制SREBP-2降低膽固醇合成[36]。因此，通過抑制miR-96能夠阻礙膽固醇合成并激活RCT，從而逆轉動脈粥樣硬化的進展。

5 展望

綜上所述，miRNA通過調節膽固醇生物合成、脂蛋白攝取、CRT等系統地維持體內膽固醇穩態。因此，miRNA表達失調可能是引發膽固醇代謝紊亂的發病機制。事實上，研究已經證明，體內膽固醇穩態是通過轉錄因子和miRNA調節網絡維持。SREBPs、LXR和FXR等細胞內甾醇傳感器已被鑒定為直接調節miRNA轉錄的因子，通過參與反饋或前反饋調節回路維持膽固醇穩態。了解轉錄因子和miRNA調控網絡將揭示機體復雜的穩態調節機制，對代謝性疾病的治療提供堅實的理論支持。