超聲波-乙醇法提取甜茶總黃酮工藝優化

鐘翠娟 王小明 張鵬 蔣敏

摘要?采用超聲波-乙醇提取法從甜茶中提取總黃酮，考察乙醇濃度、料液比、超聲波功率、提取溫度、提取時間對甜茶中總黃酮提取得率的影響，通過單因素試驗和正交試驗得出甜茶中總黃酮超聲波-乙醇提取法的最佳工藝條件為乙醇濃度60%、料液比1∶35（g∶mL）、超聲波功率80 W、提取溫度60℃、提取時間65min，此條件下，甜茶中總黃酮提取得率為7.41%。

關鍵詞?甜茶;總黃酮;超聲波;提取得率

中圖分類號?TQ461文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）20-0172-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.046

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimization of Extraction of Total Flavonoids from Sweet Tea by Ultrasonic Ethanol Method

ZHONG Cui?juan?WANG Xiao?ming ZHANG Peng1，2 et al?（1.College of Food & Biochemical Engineering，Guangxi Science & Technology Normal University，Laibin，Guangxi 546199;2.Key Laboratory for Research and Development of Characteristic Yao Medicine Resources，Guangxi Science & Technology Normal University，Laibin，Guangxi 546119）

Abstract?The effects of ethanol concentration， ratio of material to liquid， ultrasonic power， extraction temperature and extraction time on the extraction rate of total flavonoids from sweet tea were investigated by ultrasonic ethanol extraction method. The optimum extraction conditions of total flavonoids from sweet tea obtained by single factor experiment and orthogonal test were as follows： ethanol concentration 60%， ratio of material to liquid 1∶35 （g∶mL）， ultrasonic power 80 W. When the extraction temperature was 60 ℃ and the extraction time was 65 min， the extraction rate of total flavonoids in sweet tea was 7.41 %.

Key words?Sweet tea;Total flavonoids;Ultrasonic;Extraction yield

薔薇科甜茶，又名甜葉懸鉤子，在廣西被稱為“神茶”，是我國廣西唯一一種既能作處方藥又能作茶飲的天然“藥食同源”茶[1]。廣西甜茶集中分布在廣西中南部，尤以金秀大瑤山甜茶為代表。甜茶含有甜茶素、甜茶多酚和黃酮類化合物等成分[2]。飲用甜茶有潤肺、清熱、醒酒、降脂、降壓、降膽固醇、抑制和延緩血管硬化、防治冠心病及關節炎等效果;還能防治熱咳、口腔炎、咽喉炎、聲音嘶啞等癥狀[3];同時還具有提高人體免疫力的保健功能。研究證明，甜茶所含的黃酮類化合物具有重要利用價值，得到國內外食品及醫藥界廣泛重視。提取甜茶總黃酮方法有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、β-環糊精提取法、酶輔助提取法、超微粉碎法、機械化學輔助提取法等[4]。而超聲波輔助提取法具有提取時間短、提取溫度低、提取得率高等特點[5]。

該試驗采用超聲波-乙醇法從甜茶中提取總黃酮，通過單因素和正交試驗得出超聲波-乙醇法提取甜茶中總黃酮的最佳工藝條件，為甜茶葉總黃酮進一步開發和利用提供理論依據。

1?材料與方法。

1.1?材料與試劑

干甜茶，產自廣西來賓市金秀縣（甜茶葉的嫩葉與老葉比約為1∶?按綠茶加工工藝生產，水分含量49.3 g/kg，粉碎后過80目篩備用）;蘆丁標準品（95%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為分析純。

1.2?儀器與設備

電子分析天平（上海越平科學儀器有限公司）;電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械有限公司）;FW177中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）;BILON-2000CT多用途恒溫超聲波提取機（上海比朗儀器制造有限公司）;UV-2600紫外可見分光光度計（島津企業管理有限公司）等。

1.3?方法

1.3.1?總黃酮濃度測定方法。

1.3.1.1?標準曲線的測定[?6-9]。準確稱量蘆丁標準品25.0 mg于燒杯中，以60%乙醇溶液溶解并定容到250 mL容量瓶中，配制得0.1 mg/mL蘆丁標準對照液。準確移取蘆丁標準對照液0.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL于10 mL試管中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖晃混合均勻，靜置6 min，再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖晃混合均勻，靜置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液5 mL，以60%乙醇溶液定容至10 mL刻度，搖晃混合均勻，靜置20 min，得到的蘆丁標準液濃度分別是0.000、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050 mg/mL，以濃度為0.000 mg/mL的標液為空白對照，在400～700 nm下進行全波長掃描，均測出在510 nm處有最大吸光度，因此以510 nm波長為蘆丁標準液的測定波長。以蘆丁標準液濃度為縱坐標（y）和吸光度為橫坐標（x）進行線性回歸，由圖1可知，所得線性回歸方程為y=0.088 2x+0.000 002，R2=0.999 8>0.99，表明該標準曲線具有良好線性關系，可作為標準參考曲線。

1.3.1.2?顯色溶液的制備。準確移取待測樣品溶液2 mL置于10 mL試管中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖晃混合均勻，靜置6 min，再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖晃混合均勻，靜置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液5 mL，以水定容至10 mL刻度，搖晃混合均勻，靜置20 min，即得到顯色溶液。

1.3.1.3?總黃酮濃度和提取率測定。按“1.3.1.2”方法制備得到顯色溶液，以510 nm為樣品溶液測定波長，在該波長下測定顯色溶液的吸光度x?代入“1.3.1.1”線性回歸方程算出顯色溶液的總黃酮濃度y1。按公式（1）計算顯色溶液的總黃酮濃度y1;按公式（2）計算樣液溶液的總黃酮濃度y2，按公式（3）計算總黃酮提取得率。

y1（mg/mL）=0.088 2x1+0.000 002（1）

y2（mg/mL）=y12×10（2）

總黃酮的提取得率=y2×v1 000×m×100% （3）

式中，y1為顯色溶液的總黃酮濃度（mg/mL）;y2為樣品溶液的總黃酮濃度（mg/mL）;v為提取液定容體積（mL）;m為甜茶干粉質量（g）。

1.3.2?超聲波-乙醇提取總黃酮單因素試驗方法。

1.3.2.1?乙醇濃度對總黃酮提取得率的影響。取甜茶于105 ℃鼓風干燥箱中烘干2 h，經粉碎機粉碎，過80目篩備用。準確稱取甜茶干粉末各2 g置于250 mL燒杯中，以甜茶總黃酮提取得率為評價指標進行單因素試驗，分別研究不同體積分數乙醇對超聲波-乙醇提取甜茶總黃酮的影響。按甜茶粉末質量與乙醇體積比1∶30（g∶mL）、超聲波功率80 W、提取溫度50 ℃、提取時間45 min，開展不同乙醇濃度（50%、55%、60%、65%、70%）提取甜茶葉總黃酮得率的單因素試驗。提取液于4 500 r/min離心分離6 min，收集上清液，用蒸餾水清洗沉淀，離心分離2次收集上清液，將上清液定容于1 000 mL容量瓶中，測定甜茶總黃酮提取得率，找出最佳乙醇濃度[9-12]。

1.3.2.2?料液比對總黃酮提取得率的影響。準確稱取甜茶干粉各2 g置于250 mL燒杯中，以甜茶總黃酮提取得率為評價指標進行單因素試驗，分別研究不同甜茶粉質量與乙醇體積比對超聲波-乙醇提取甜茶總黃酮的影響。按單因素試驗所得的最佳乙醇濃度、超聲波功率80 W、提取溫度50 ℃、提取時間45 min，開展不同料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g∶mL））對提取甜茶總黃酮得率的單因素試驗。提取液于4 500 r/min離心分離6 min，收集上清液，用蒸餾水清洗沉淀，離心分離2次收集上清液，將上清液定容于1 000 mL容量瓶中，測定甜茶總黃酮提取得率，找出最佳甜茶粉質量與乙醇體積比（料液比）。

1.3.2.3?超聲波功率對總黃酮提取得率的影響。準確稱取甜茶干粉各2 g置于250 mL燒杯中，以甜茶總黃酮提取得率為評價指標進行單因素試驗，分別研究不同超聲波功率對超聲波-乙醇提取甜茶總黃酮的影響。按單因素試驗所得的最佳乙醇濃度、最佳料液比、提取溫度50 ℃、提取時間45 min，開展不同超聲波功率（40、60、80、100、120 W）對提取甜茶總黃酮得率的單因素試驗。提取液于4 500 r/min離心分離6 min，收集上清液，用蒸餾水清洗沉淀，離心分離2次收集上清液，將上清液定容于1 000 mL容量瓶中，測定甜茶總黃酮提取得率，找出最佳超聲波功率。

1.3.2.4?提取溫度對總黃酮提取得率的影響。準確稱取甜茶干粉各2 g置于250 mL燒杯中，以甜茶總黃酮提取得率為評價指標進行單因素試驗，分別研究不同提取溫度對超聲波-乙醇提取甜茶總黃酮的影響。按單因素試驗所得的最佳乙醇濃度、最佳料液比、最佳超聲波功率、提取時間45 min，開展不同提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）對提取甜茶總黃酮得率的單因素試驗。提取液于4 500 r/min離心分離6 min，收集上清液，用蒸餾水清洗沉淀，離心分離2次收集上清液，將上清液定容于1 000 mL容量瓶中，測定甜茶總黃酮提取得率，找出最佳提取溫度。

1.3.2.5?提取時間對總黃酮提取得率的影響。準確稱取甜茶干粉各2 g置于250 mL燒杯中，以甜茶總黃酮提取得率為評價指標進行單因素試驗，分別研究不同提取時間對超聲波-乙醇提取甜茶總黃酮的影響。按單因素試驗所得的最佳乙醇濃度、最佳料液比、最佳超聲波功率、最佳提取溫度，開展不同提取時間（25、35、45、55、65 min）對提取甜茶總黃酮得率的單因素試驗。提取液于4 500 r/min離心分離6 min，收集上清液，用蒸餾水清洗沉淀，離心分離2次收集上清液，將上清液定容于1 000 mL容量瓶中，測定甜茶總黃酮提取得率，找出最佳提取時間。

1.3.3?正交試驗優化方法。

根據單因素試驗結果，選擇乙醇濃度、料液比、超聲波功率、提取溫度和提取時間為5個主要考察因素，每個因素設3個水平，采用L18（37）設計正交試驗，正交試驗因素和水平表如表1。以總黃酮提取得率為評價指標，進行正交試驗優化。

2?結果與分析

2.1?單因素試驗結果與分析

2.1.1?乙醇濃度對甜茶總黃酮提取得率的影響。

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增大，甜茶總黃酮提取得率呈現先升高后降低的趨勢，在乙醇濃度為60%時提取得率最大。這可能是由于甜茶中有其他醇溶性雜質，當乙醇濃度增大時，高濃度乙醇可以沉淀甜茶中的粗蛋白、寡糖和多糖等，這些被沉淀的物質可能夾雜或包裹一部分總黃酮，導致總黃酮提取得率下降。因此，選定最佳乙醇濃度為60%。

2.1.2?料液比對甜茶總黃酮提取得率的影響。

由圖3可知，隨著料液比不斷增大，總黃酮提取得率先上升后略有下降，當甜茶粉質量與乙醇體積比為1∶35時，提取得率最大。這可能是由于甜茶粉質量與乙醇體積比在1∶20至1∶35時，適當加大溶劑體積，甜茶粉可以完全浸泡在溶劑中，甜茶粉總黃酮能夠更加充分地溶解在溶劑中，總黃酮提取得率呈上升趨勢;而之后繼續將料液比增大，提取得率開始呈現緩慢下降趨勢，這可能是由于隨著料液比增大，溶劑也吸收一部分超聲波，溶質分到的超聲波相對減少，從而降低了細胞對超聲波的吸收量，細胞被破碎得不夠充分，導致部分總黃酮未被溶出而使提取得率下降。因此，選定最佳料液比為1∶35。

2.1.3?超聲波功率對甜茶總黃酮提取得率的影響。

由圖4可知，超聲波功率由40 W上升至80 W時，甜茶總黃酮提取得率明顯呈上升趨勢，當大于80 W時，甜茶總黃酮提取得率降低。研究表明，在超聲波輔助提取法中，利用超聲波的強震動、高加速度、強空化效應和強攪拌作用促進細胞破裂，使甜茶總黃酮在較短時間內進入溶劑。超聲波功率較低時，超聲波對細胞的破碎程度不夠顯著，所以提取得率較低。而當超聲波功率增大時，分子之間運動強度加劇，從而使甜茶總黃酮提取得率增大。但當超聲波功率過大時，可能由于分子之間運動強度過于劇烈，導致甜茶中活性物質之間發生反應，從而使甜茶總黃酮受到破壞，所以超聲波功率大于80 W時甜茶總黃酮提取得率出現下降現象。因此，選定最佳超聲波功率為80 W。

2.1.4?提取溫度對甜茶總黃酮提取得率的影響。

由圖5可知，提取溫度在30～50 ℃時，隨著提取溫度不斷升高，甜茶總黃酮提取得率明顯呈上升趨勢，當溫度達50 ℃時，提取得率最大。原因是隨著溫度升高，分子之間的運動速率加快，使得甜茶總黃酮溶解、擴散到溶劑中的速率也隨之加快。較高溫度還可增加細胞膜通透性，使甜茶中的總黃酮更容易滲透出來，從而提高了提取得率。而當溫度高于50 ℃時，提取得率出現緩慢下降趨勢，可能的原因是高溫促進黃酮類化合物與其他物質之間發生化學反應，尤其是氧化還原反應，導致總黃酮損失而出現提取得率降低。因此，選定最佳提取溫度為50 ℃。

2.1.5?提取時間對甜茶總黃酮提取得率的影響。

由圖6可知，提取時間為25～55 min時，隨著提取時間不斷延長，甜茶總黃酮提取得率明顯呈上升趨勢，當提取時間達55 min時提取得率最大，而當提取時間繼續延長時，提取得率呈現緩

慢下降的趨勢。可能的原因是隨著提取時間的延長，超聲波和溫度共同作用促使黃酮類化合物與其他物質之間發生化學反應，尤其是氧化還原反應，導致總黃酮損失而出現提取得率緩慢降低。因此，選定最佳提取時間為55 min。

2.2?正交試驗結果與分析

由表2可知，影響甜茶總黃酮提取得率的主次因素依次為料液比、超聲波功率、提取溫度、乙醇濃度、提取時間，最優方案為A2B2C2D3E 即乙醇濃度60%、料液比1∶35、超聲波功率80 W、提取溫度60 ℃、提取時間65 min。正交表中有該試驗工藝組合，且該試驗工藝組合的提取得率7.41%大于正交表中的其他工藝組合，因此確定該工藝組合為最優工藝組合。

3?結論

影響甜茶總黃酮提取得率的主次因素依次為料液比、超聲波功率、提取溫度、乙醇濃度、提取時間，甜茶中總黃酮超聲波-乙醇提取法的最佳工藝條件為乙醇濃度60%、料液比1∶35、超聲波功率80 W、提取溫度60 ℃、提取時間65 min。此條件下，甜茶中總黃酮提取得率為7.41%。

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