兔子血液、滑膜、軟骨及軟骨下骨鎘含量檢測及相關性分析

馬向輝 李明 郭磊

[摘要]目的 研究兔慢性飲水型鎘中毒血液、滑膜、軟骨及軟骨下骨鎘含量及其相關性。方法 28只新西蘭大白兔，均為兩個半月齡，雌雄各半，從雌性及雄性大白兔中各隨機取1只，逐次抓取，將其分為對照組及實驗組，每組14只，單籠喂養。對照組用正常飲用水喂養，實驗組用40 mg/L氯化鎘飲用水喂養。3個月后處死，采用原子吸收光譜法測定標本中鎘的含量。結果 實驗組兔子血液，滑膜、軟骨及軟骨下骨鎘含量較對照組表達明顯增高（P<0.05），實驗組關節軟骨鎘含量與軟骨下骨、滑膜及血液中的鎘含量成正相關（r=0.959，0.556，0.942;P<0.05）。結論 兔慢性飲水型鎘中毒可導致鎘在血液、滑膜、關節軟骨及軟骨下骨中蓄積，關節軟骨中的鎘來源于軟骨下骨、滑膜及血液，但主要來源于軟骨下骨，鎘在上述組織中蓄積，最終可能會導致骨性關節炎發生。

[關鍵詞]鎘;中毒;軟骨;骨關節炎;兔;膝

[中圖分類號] R114? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）9（c）-0038-03

[Abstract] Objective To study the content and correlation of cadmium in blood， synovium， cartilage and subchondral bone of rabbits after drinking water with cadmium gradually. Methods Twenty-eight New Zealand white rabbits （equal proportion of male to female） aged two and a half months old， were randomly selected from female and male groups alternatively. They were divided into control group and experimental group， 14 rabbits in each group. They were fed in every single cage. In the control group， rabbits were fed with normal drinking water， and in the experimental group， they were fed with water containing 40 mg/L cadmium chloride. After three months， all rabbits were sacrificed. The cadmium content in the specimens was determined by atomic absorption spectrometry. Results The cadmium content in the blood， synovium， cartilage and subchondral bone of the experimental group was significantly higher than that of the control group （P<0.05）. The cadmium content of the articular cartilage in the experimental group was positively correlated with the cadmium content in the subchondral bone， synovium and blood（r=0.959， 0.556， 0.942; P<0.05）， respectively. Conclusion Chronic poisoning of drinking water containing cadmium can cause cadmium accumulation in blood， synovium， articular cartilage and subchondral bone. Cadmium in articular cartilage is derived from subchondral bone， synovium， and blood， but mainly from subchondral bone. Cadmium accumulates in these tissues and may eventually lead to osteoarthritis.

[Key words] Cadmium; Poisoning; Cartilage; Osteoarthritis; Rabbit; Knee

鎘是一種有毒的重金屬，具有很強的生物活性，鎘在土壤及水中具有較強的化學活性，進入食物鏈后，若被人及動物攝入，會在體內蓄積，影響多種臟器功能。研究較多的是鎘易在骨及腎臟大量蓄積導致骨質疏松及腎臟的損傷[1]，但鎘是否易在關節軟骨及滑膜等處蓄積，是否影響其功能，以及如何影響，目前研究較少，本研究通過飲水的方式使兔子染毒，然后測定兔子血液、滑膜、軟骨及軟骨下骨的鎘含量，并對其相關性進行分析，現報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物

健康新西蘭大白兔28只，山西醫科大學實驗動物中心提供，均為2個半月齡，平均體重（1.38±0.18）kg，雌雄各半。

1.2實驗方法

將28只新西蘭大白兔隨機分成兩組，雌雄各半，每組14只。置于鐵籠內，自由攝食及飲水，采用飲水染毒的方法，實驗組用40 mg/L氯化鎘飲用水喂養，對照組用正常飲用水喂養，其他條件相同。在染毒期間，每日觀察并記錄每組大白兔的飲水量，飼養3個月后用空氣栓塞法處死，開胸后用10 ml注射器從左心室取全血5 ml，放入含抗凝劑的玻璃瓶中-70℃保存。完整剖取雙膝關節（包括股骨遠端及脛骨近端）全層軟骨，剝取雙膝關節內滑膜，取脛骨平臺處部分軟骨下骨，分別放入玻璃瓶中-70℃保存。用15 ml消解液（HNO3與HLO4按4∶1混合）與準確稱量質量的標本相混合，完全消化后，用容量瓶定容至50 ml，然后取定容液2 ml，采用原子吸收光譜法測定標本中鎘的含量。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗及直線相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組不同組織鎘含量的比較

實驗組關節軟骨、滑膜、血液及軟骨下骨鎘含量均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2實驗組關節軟骨鎘含量與滑膜、血液及軟骨下骨鎘含量相關性分析

關節軟骨鎘含量與滑膜鎘含量成正相關（r=0.556，P=0.039）;與血液鎘含量成正相關（r=0.942，P=0.000）;與軟骨下骨鎘含量成正相關（r=0.959，P=0.000）。其中軟骨下骨鎘含量相關度最高，血液及滑膜次之。

3討論

血鎘水平可反映兔子體內鎘蓄積的程度及近期鎘暴露的情況，實驗組兔血液中鎘含量較對照組明顯升高，與其飲用富含鎘的水密切相關。鎘經消化道吸收后進入兔體內，部分存在于紅細胞中與血紅蛋白結合，部分存在于血清中，實驗組兔滑膜及軟骨鎘含量均高于對照組，提示其均為鎘蓄積的器官，兔滑膜組織中有血液循環，分析鎘是通過血液循環進入滑膜的，由于正常關節軟骨中沒有血液循環，關節軟骨中的鎘應該來源于與其相鄰的有血液循環的軟骨下骨和滑膜，軟骨下骨中的血液中所含的鎘被軟骨細胞吸收，滑膜中的鎘分泌入關節液后，關節軟骨細胞將其吸收可能是關節軟骨中鎘的來源。

關節滑膜由基質和細胞及纖維構成。內表層平滑，為1～3層結締組織細胞，又稱滑膜細胞，電鏡下可見彼此分開而以細棘相連。因功能狀態不同可分A及B兩種類型。A型滑膜細胞主要清除關節腔和細胞外基質的降解物，B型滑膜細胞合成和調節細胞外基質和滑液的成分。細胞層下方即為毛細血管網，其下為纖維組織，其厚度因部位而不一，含有血管、淋巴管和神經纖維，細胞成分有纖維細胞、巨噬細胞、肥大細胞和脂肪細胞。

關節滑膜可參與關節軟骨的破壞過程[2-3]，滑膜發炎時，可以產生多種炎癥介質，如白介素-1（IL-1），腫瘤壞死因子（TNF-α）。IL-1可促進滑膜細胞合成并釋放前列腺素E2（PGE2）、NO和膠原酶，產生較強的促炎作用，加重滑膜的炎癥，能刺激滑膜成纖維細胞增殖，促進滑膜細胞與黏附分子（ICAM-1）的表達，造成關節軟骨破壞，而關節軟骨破壞產生的顆粒及基質的破壞產物均能誘發和加重滑膜炎，促進IL-1進一步釋放。TNF-α可刺激滑膜細胞PGE的產生，增加骨軟骨的破壞。IL-1和TNF-α均可導致關節軟骨細胞產生降解軟骨基質的酶MMP-1、3、13等，從而使關節軟骨破壞，導致關節軟骨退變發生[4-5]。骨性關節炎又稱退行性關節病，骨質增生，骨關節病。以軟骨變性為特征性病理改變。李保馳等[6]研究發現，骨性關節炎患者滑膜中的MMP-3及MMP-13表達明顯上調。本實驗鎘在滑膜中蓄積，是否導致滑膜炎發生，尚需對滑膜進行組織學染色觀察及對相關因子及酶進行檢測以明確。

關節軟骨由軟骨細胞，軟骨基質及水組成。軟骨細胞具有合成分泌并維持細胞外基質的功能。細胞外基質由膠原蛋白、蛋白纖維、組織液、非膠原蛋白組成，膠原纖維構成關節軟骨的基本框架，維持關節軟骨形態結構和抗張力強度的功能。組織液和基質大分子間的相互作用為組織提供硬度和抗機械壓力，蛋白多糖帶有大量負電荷，可吸附水分子，使軟骨具有彈性，抗壓性。

軟骨下骨指關節軟骨沉積線以下的軟骨下骨板和骨小梁結構，軟骨下骨板位于鈣化軟骨層與骨小梁之間，為皮質化板層結構，類似于皮質骨。起傳導分散應力，抵抗剪切力，緊密聯系骨軟骨的作用。

軟骨與軟骨下骨在解剖位置上緊密相鄰，生理功能方面密切聯系，病理方面相互影響，是一個相互作用、相互依賴、既獨立又統一的功能單位。Radin等[7]認為，軟骨下骨像一把堅硬的椅子，而關節軟骨就像放在上面的軟墊，軟骨下骨能吸收應力，緩沖震蕩，維持關節的正常形狀。在負重狀態下，關節軟骨發生形變，猶如鐵軌與枕木之間的橡皮墊，可以保護軟骨下骨不受破壞，或者僅發生輕微的損傷。當解除壓力，由于彈性作用可迅速恢復原狀，這種彈性作用越強，緩沖效果越佳。有研究表明鎘可導致骨質疏松[1，8-9]，發生骨質疏松時，軟骨下骨脫鈣明顯，骨量減少，骨小梁數量下降，間距增加，吸收應力能力下降，容易出現微骨折，導致軟骨下骨塌陷，正常關節形狀發生改變，從而出現關節面受力不均，受力較集中的區域軟骨容易發生退行性變。Bobinac等[10]認為，在骨性關節炎中是關節軟骨的退行性變導致軟骨下骨的生物力學及生化學方面改變，應用組織學及組織化學方法對人工膝關節置換患者及正常尸體膝關節進行研究，結果顯示軟骨下骨形態學改變發生于關節軟骨退變后，且與關節軟骨退變程度成正相關。

本研究結果提示，鎘可在兔關節軟骨及軟骨下骨中異常蓄集，可能會導致骨質疏松發生，關節軟骨亦可能出現損傷退變，最終導致骨性關節炎發生，但骨質疏松與關節軟骨發生的先后及相互影響的機制需進一步研究。

有研究顯示[11-12]，鎘能引起細胞凋亡。Corcoran等[13]研究結果現示，DNA損傷是引發細胞凋亡的開始。關于鎘如何引起DNA損傷，從而導致細胞凋亡，目前有鈣通道學說及鎘影響如c-jun，c-fos，c-myc等癌基因，抑癌基因p53等學說[14]。而最近有研究顯示鎘可通過鈣通道誘導大鼠腎小管上皮細胞凋亡[15]。

軟骨細胞凋亡在骨性關節炎中發揮重要作用。Gibson等[16]在終末分化的軟骨細胞培養時發現軟骨細胞中存在凋亡現象，裴明等[17]研究結果顯示，關節軟骨退變時，患者不僅軟骨細胞表達A型膠原，而且存在軟骨細胞凋亡現象。骨性關節炎患者軟骨退變，軟骨細胞減少，軟骨細胞過度調亡可能是軟骨細胞數量減少的重要原因，是發病的重要病理機制，本實驗是否導致慢性飲水型鎘中毒的兔膝關節軟骨細胞出現凋亡目前尚不明確。

本研究結果提示，慢性飲水型鎘中毒可導致鎘在血液、滑膜、關節軟骨及軟骨下骨中異常蓄積，推測持續蓄積可能導致骨性關節炎發生。進一步研究滑膜、關節軟骨及軟骨下骨形態學方面的變化及骨性關節炎相關的因子如IL-1、TNF-α以及金屬蛋白酶MMP-3、13等在相關組織中的表達及調控機制能進一步加深對鎘在上述組織中蓄積相互間影響的認識。鎘可導致多種細胞出現凋亡，但能否導致兔膝關節軟骨出現凋亡及作用機制尚不明了，仍需進一步研究。

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（收稿日期：2018-05-29? 本文編輯：崔建中）