182 份東北地區受保護大豆品種DNA 指紋庫的構建及分析

趙艷杰 馮艷芳 黃思思 馬瑩雪 李嬡嬡 張 蝶 鄧 超 韓瑞璽 唐 浩

（農業農村部科技發展中心，北京 100176）

近年來，隨著人們品種權意識的日益增強，且《種子法》中要求品種登記、審定、保護均需要通過特異性（可區別性，Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩定性（Stability）的測試（簡稱DUS測試），因此植物品種DUS 測試工作任務量不斷加大，加之我國培育、審定和保護大豆新品種速度的加快，大豆骨干親本的使用使得品種間的遺傳多樣性降低，單純依據表型性狀進行品種田間檢驗越來越困難，因此對DUS 測試技術的要求越來越高[1]。以分子標記為基礎的DNA 指紋鑒定技術具有準確可靠、簡單快速的優點，指紋圖譜是鑒別品種的有力工具[2]，因此建立以分子標記為基礎的DNA 指紋圖譜能夠為特異性（可區別性）判定時輔助篩選近似品種和解決品種糾紛提供技術支持。

我國在大豆DNA 指紋圖譜構建方面取得了一定的成果，田清震[3]利用AFLP 分子標記技術，建立了我國代表性野生大豆和栽培大豆種質的指紋圖譜。趙洪錕等[4]利用RAPD 分子標記技術，構建了64 份吉林省大豆骨干親本及主推品種的DNA 指紋圖譜。高明[5]利用SSR 分子標記技術構建了89 個吉林省推廣大豆品種的DNA 指紋圖譜，并進行遺傳多樣性分析。徐海風等[6]用45 對SSR 引物對43 份大豆品種（系）進行遺傳相似性分析，并構建指紋圖譜。陳亮等[7]從320 對SSR 標記引物中篩選出由7個SSR 標記構建了吉林省新育成大豆品種的DNA指紋圖譜。徐冬雪等[8]以參加2016 年河北省區域試驗的21 個大豆品系為材料，用62 對SSR 引物構建了指紋圖譜。而針對東北地區申請保護大豆品種DNA 指紋圖譜構建和遺傳多樣性分析還未見報道。

截止到2018 年11 月份，東北地區受保護的大豆品種數量占將近一半，本研究利用均勻分布于大豆染色體的40 對SSR 引物，對東北地區已獲得植物新品種權的182 份大豆品種進行遺傳分析，同時構建其DNA 指紋圖譜庫，為DUS 測試中輔助篩選近似品種和解決品種糾紛奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料182 份來自東北地區申請植物新品種保護大豆授權品種（表1）。

1.2 DNA 提取從每個品種中取50 粒種子，放在裝有適量濕沙土的發芽盒內于人工氣候培養箱發苗，每個樣品隨機取葉片20 片以上，液氮研磨后，用改良的CTAB 法提取種子DNA[9]。

1.3 SSR 標記檢測及數據分析品種區分效果好、峰型易讀的40 對SSR 引物由黑龍江省農業科學院作物育種研究所推薦（表2），熒光引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。PCR 體系含1×TaqMan?Gene Expression Master Mix、30ng DNA，加ddH2O 補足20μL。95℃預變性5min，94℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s～1min 30s，共32 個循環；72℃延伸10～15min，16℃條件下保存。將PCR 產物進行適當稀釋后，取1μL 稀釋液加8.5μL 去離子甲酰胺、0.5μL Liz-500 分子量內標，于ABI 3730DNA 分析儀上進行毛細管電泳檢測。利用北京市農林科學院玉米中心開發的SSR 指紋分析器采集擴增產物的片段大小。采用Powermarker V3.25 軟件進行聚類分析，用Figtree 模塊生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1 SSR 標記多態性分析分析182 份大豆品種40 對SSR 引物標記多態性，共擴增出266 種多態性基因型，每對引物的基因型表現從4～20 種不等，平均每對引物擴增出11.05 種基因型。

2.2 遺傳多樣性分析利用Powermarker V3.25軟件進行遺傳相似性分析，結果表明，182 個大豆品種間遺傳相似系數的變化范圍是0.4887（黑交00-1152 與野褐1 號）～1.0000（龍墾335、合農75 和合豐50 號），平均為0.7785。從聚類分析結果（圖1）來看，182 份大豆品種可聚合為13 大類，龍墾331 單獨為一類；墾豐16、墾豆26 號、墾豆38、墾豆37、墾豆28、墾豆36、墾豆39、墾豆33 聚合在一起；黑農70、黑農64、黑農68、黑農66、黑農69 聚合在一起，說明上述8 個墾豆系列品種和5個黑農系列品種遺傳基礎較窄。除此之外，合農系列、吉育系列、綏農系列品種分布較遠，說明遺傳基礎較遠。

龍墾335、合農75 和合豐50 號具有相同的DNA指紋，查詢DUS 測試數據庫中3 個品種的田間表型數據，合農75 和合豐50 號在“下胚軸：花青甙顯色強度”等5 個性狀上有1 個代碼差異，表型相近，合農75 和龍墾335 在“莖：茸毛密度”等14 個性狀上有1～3 個代碼差異，表型差異較大（表3）。

3 討論

大豆是高度自交結實作物，遺傳基礎狹窄。邱麗娟[10]發現18 個美國大豆品種提供了美國85%的育成品種的遺傳物質。崔章林[11]分析了中國651 個大豆品種的系譜，認為中國東北、黃淮海地區和南方3 大產區衍生品種最多僅38 個祖先親本。本研究利用40 對SSR 引物對182 份東北地區已授植物新品種保護權的品種進行分析，發現其平均相似系數為0.7785，遺傳基礎較窄，又由于育種采用大豆品種同質化嚴重，加大了DUS 測試中特異性鑒定的難度。除此之外，8 個墾豆系列品種和5 個黑農系列品種緊密聚合在一起，說明同一育種單位育成的新品種遺傳多樣性低，因此在大豆的新品種選育上可考慮拓寬遺傳基礎。

表1 182 份來自東北地區申請植物新品種保護大豆授權品種

表2 SSR 標記引物

圖1 182 份東北地區申請保護大豆品種UPGMA 聚類圖

《種子法》中規定“農業、林業主管部門可以采用國家規定的快速檢測方法對生產經營的種子品種進行檢測，檢測結果可以作為行政處罰依據”。由于基因與性狀的關系并不都是簡單的線性關系，基因與基因、基因與基因產物、基因與環境之間存在著復雜的相互關系，分子檢測結果與田間表型鑒定結果也無必然關聯。本研究中，龍墾335、合農75 和合豐50 號DNA 指紋相同，合農75 和合豐50 號表型相近，說明了構建大豆DNA 指紋數據庫在特異性（可區別性）判定時輔助篩選近似品種具有一定的參考意義；合農75 和龍墾335 表型差距較大，說明品種特異性（可區別性）的最終判定不能僅僅依靠分子鑒定，還需要依靠田間種植對比試驗。

表3 龍墾335、合農75 和合豐50 號的田間鑒定結果