補肺化瘀湯對氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠的影響

馮 原，江 穎，周 穎，劉 銳，謝有科，李健哲，朱 林，林偉楠，宋盛娥，韋露璐

（1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院呼吸內科，廣西 南寧530011；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院神經內科，廣西 南寧530011；3.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院腫瘤放療科，廣西 南寧530011；4.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院老年病科，廣西 南寧530011；5.廣西中醫藥大學附屬瑞康腫瘤內科，廣西 南寧530011；6.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院藥學部，廣西 南寧530011）

肺癌主要分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）兩大類，其中NSCLC 約占肺癌的85%［1-3］。在全球范圍內，肺癌是目前威脅人類生命健康的重大疾病之一，是腫瘤中發病率和死亡率最高的疾病［4］。我國肺癌的發病率呈持續上升的趨勢，并且城市的發病率遠遠高于農村。由于環境污染、吸煙、人口基礎龐大等因素，我國將成為世界第一肺癌大國［5］。因此，采取積極有效的措施防治肺癌成為當務之急。

氣虛血瘀證是指氣虛運血無力，血行瘀滯而表現的癥候［6-7］。常由病久氣虛，漸致瘀血內停而引起。臨床常表現為面色淡白或晦滯、身倦乏力、氣少懶言、疼痛如刺、常見于胸脅、痛處不移、拒按、舌淡暗或有紫斑、脈沉澀［8-9］。此外，氣虛血瘀證是晚期非小細胞肺癌的一個重要證型，血液高凝狀態及免疫功能低下是該證的重要病理基礎［10-11］。目前，中醫藥已經成為肺癌治療的重要組成部分。中醫藥在諸多方面，如穩定瘤灶、延長生存期、增強機體免疫功能、改善臨床癥狀、提高生活質量、減輕放化療毒副作用等均顯示出一定的療效和優勢。因此，依據中醫藥的基本理論，針對氣虛血瘀證采取有效的治療將有可能成為治療肺癌的有效手段。

因此，本研究將考察補肺化瘀湯是否可以抑制氣虛血瘀證小鼠Lewis 肺癌的增殖，并探討補肺化瘀湯的抗腫瘤作用機制。

1 材料

1.1 藥物 補肺化瘀湯的配方主要黨參、黃芪、生地、鱉甲、白花蛇舌草、半枝蓮、生地、赤芍、丹參、莪術、三棱、川芎、紫苑、前胡、杏仁、甘草組成，藥材購于北京同仁堂，并經河北省滄州中西醫結合醫院藥劑科閆國強主任藥師鑒定為正品，均符合2015年版《中國藥典》 規范。

1.2 動物及細胞株 Lewis 肺癌細胞購于中國科學院上海生命科學生物化學與細胞生物學研究所。C57BL／6小鼠購于北京華阜康科技股份有限公司［生產許可證SCXK（京）2019-0008］，飼養在恒溫、恒濕動物房內，飼料、飲水等均經高壓蒸汽滅菌。

1.3 試劑 RPMI1640培養基購于美國Gibco 公司（批 號090817）；優級胎牛血清（FBS，批 號0928427）購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；青霉素-鏈霉素（批號01234127）、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（批號01923）均購自上海碧云天生物技術有限公司；羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，批號02427）、胰蛋白酶（Trypsin，1 ∶250，批號09283）均購買于美國Sigma Chemical 公司；一 抗 caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、βactin 購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司（批號分別 為sc-7272、sc-24528、sc-4239、sc-509、sc-8432）。

1.4 儀器 全自動血流變儀購自河南世輝醫療器械有限公司（批號0124）；Western blot 電泳儀及轉膜儀器購自Bio-rad 公司（批號034124）。

2 方法

2.1 補肺化瘀湯有效成分提取 補肺化瘀湯組方為黨參20 g、黃芪15 g、生地10 g、鱉甲10 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g、生地10 g、赤芍15 g、丹參10 g、莪術10 g、三棱10 g、川芎10 g、紫苑10 g、前胡10 g、杏仁10 g、甘草6 g。用蒸餾水煎成補肺化瘀湯藥液，濃縮配制成含生藥量2 g／mL，過濾，分裝，4 ℃保存。

2.2 建立氣虛血瘀證小鼠模型 60只C57BL／6小鼠，5周齡，SPF 級，雄性，體質量20～22 g。隨機取10只小鼠作為空白對照組，在正常環境下飼養，其余50只參照文獻采用多因素刺激制作氣虛血瘀證模型［8］。高脂高糖飲食，84.5%基礎飼料加入5% 蛋黃粉、0.5% 膽固醇、5% 豬油、5% 蔗糖。睡眠剝奪，采用不可預知的慢性睡眠剝奪方法進行刺激，包括按常相光照（8：00至20：00光照，20：00至8：00黑暗）、反相光照（8：00至20：00黑暗，20：00至8：00光照）、持續光照及持續黑暗4個過程（4個過程為1個階段），每個階段為7 d，連續重復6周，在每個階段中4個過程隨機安排，每個階段對小鼠進行48 h 睡眠剝奪，發現小鼠進入睡眠時，低電壓刺激促使小鼠保持清醒，使小鼠無法進入睡眠狀態。小鼠分為對照組、氣虛血瘀組及補肺化瘀湯低、中、高劑量組（0.7、1.4、2.8 g／kg）。按照相當于人等效劑量的5倍、10倍、20倍得到補肺化瘀湯低、中、高劑量，灌胃給藥，1次／d，連續給藥15 d。

實驗期間觀察記錄小鼠行為表現、癥狀體征。實驗期間取血測定血液流變指標，以驗證氣虛血瘀證動物模型成功。

2.3 建立氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠模型 取對數生長期的Lewis 肺癌細胞，消化、離心、計數后，重懸制 備成濃度為1 × 107／mL 細胞懸液，0.2 mL／只接種于氣虛血瘀小鼠右后肢皮下。根據瘤體積，將50只小鼠分成模型組、陽性藥對照組（1 mg／kg 順鉑）及補肺化瘀湯低、中、高劑量組（0.7、1.4、2.8 g／kg），每組10只。按照相當于人等效劑量的5倍、10倍、20倍得到補肺化瘀湯低、中、高劑量，灌胃給藥，1次／d；模型組給予等體積生理鹽水灌胃、正常喂養；陽性藥對照組按1 mg／kg 劑量，腹腔注射順鉑，1次／d，連續給藥15 d。

隔天觀察小鼠的活動狀態和精神狀態等，稱量并記錄小鼠的體質量，取各組的平均值，繪制體質量變化曲線。游標卡尺測量荷瘤小鼠腫瘤的長短徑，a 代表腫瘤最短徑，b 代表腫瘤最長徑，腫瘤體積=1／2×a2×b，繪制腫瘤生長曲線。腫瘤生長抑制率=［（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）／模型組平均瘤重］×100%。剝離各組小鼠的心臟、脾臟、雙肺、腎臟、肝臟等組織稱定質量，臟器指數（mg／g）=臟器重（mg）／體質量（g）。

2.4 TUNEL 染色 石蠟切片二甲苯浸洗2次×5 min脫蠟，遞減梯度酒精（100%、95%、90%、85%、70%）水化，3 min／次，PBS 漂 洗2次，5 min／次，滴加新配制蛋白酶K 工作溶液，室溫下靜置15 min，制備TUNEL 反應混合液，實驗組用50 μL TdT＋450 μL 熒光素酶標記的dUTP 液混勻，取50 μL 混合液加在玻片上，陰性對照組只加50 μL熒光素酶標記的dUTP 液，于暗濕盒中37 ℃孵育1 h，PBS 漂洗3次，5 min／次，玻片干后加50 μL converter-POD 于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37 ℃反應30 min，PBS 漂洗3次，5 min／次，在組織處加50 μL DAB 底物，室溫孵育5 min，PBS 漂洗3次，5 min／次，蘇木素復染3 s后，立即用自來水沖洗，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。于光學顯微鏡下觀察凋亡細胞并拍照。

2.5 Western blot 取出荷瘤鼠腫瘤組織置于研缽中，液氮條件下用研磨棒研磨，將組織轉移至EP管中，加入適量RIPA 裂解液及PMSF 蛋白酶抑制劑，超聲波粉碎30 s，冰上裂解30 min 后，4 ℃12 000 r／min 離心30 min 沉淀組織碎片，取上清，BCA 法進行蛋白定量。SDS-PAGE 凝膠，常規電泳，轉膜，5% 脫脂奶粉封閉，一抗（1 ∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1 ∶5 000）室溫孵育2 h，ECL 顯色。采用Image J2圖像分析軟件對蛋白灰度值進行分析。

2.6 統計學分析 應用SPSS 22.0統計學軟件。計量資料以（）表示。組間比較采用One-Way ANOVA 分析，多重比較在方差齊性時用Bonferroni方法，方差不齊性時用Dunnett T3方法。P＜0.05差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 氣虛血瘀證小鼠模型的建立及表征觀測 通過疲勞、驚恐、高脂飲食等刺激方法，造模組小鼠出現不同程度的氣虛血瘀證表型，具體表現為倦怠嗜睡，精神萎頓，活動性較差，運動時間短，體質量下降，過勞后氣短喘息，毛發稀疏且容易脫落，舌質顏色暗淡，尾部出現不同程度的皮下瘀紫或青斑；而對照組小鼠則活動靈活，毛色潔白光澤，未見尾部青斑，體質量正常，未見其他異常表現。詳細記錄對照及模型組小鼠的體質量、運動（游泳）時間及運動后的排便量，如表1所示，與對照組比較，氣虛血瘀模型組小鼠的體質量和游泳時間明顯減少，而游泳后的排便量明顯增加（P＜0.01），表明氣虛血瘀小鼠的氣虛體弱、乏力及便溏癥狀。

表1 氣虛血瘀證小鼠相關指標評定（）Tab.1 Evaluation of relevant indicators for identification of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern in mice（）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

3.2 補肺化瘀湯對氣虛血瘀證小鼠血液流變學指標的影響 與對照組比較，氣虛血瘀組的高、中、低切變率，血漿黏度顯著地升高（P＜0.05，P＜0.01），血漿凝血酶原時間（PT）、活化的部分凝血活酶時間（APTT）、血漿纖維蛋白原（FIB）水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；而補肺化瘀湯組能顯著逆轉氣虛血瘀組血液流變學指標（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 補肺化瘀湯對氣虛血瘀證小鼠血液流變學指標的影響（， n=10）Tab.2 Effects of Bufei Huayu Decoction on hemorheological parameters in mice of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern（， n=10）

表2 補肺化瘀湯對氣虛血瘀證小鼠血液流變學指標的影響（， n=10）Tab.2 Effects of Bufei Huayu Decoction on hemorheological parameters in mice of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern（， n=10）

注：與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與氣虛血瘀組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

3.3 氣虛血瘀Lewis 肺癌小鼠模型的建立 將處于生長對數期的Lewis 肺癌細胞懸液接種至氣虛血瘀模型小鼠的右后肢皮下，接種1周后成瘤，見圖1。

圖1 氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠模型的建立Fig.1 Establishment of mouse models with Lewis lung cancer of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern

3.4 補肺化瘀湯對氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠腫瘤生長、臟器指數及體質量的影響 補肺化瘀湯組、陽性藥對照組腫瘤體積、腫瘤重均顯著低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），且呈濃度依賴性地抑制腫瘤生長。順鉑陽性藥對照組抑瘤率為59.15%，補肺化瘀湯低劑量為17.98%，補肺化瘀湯中劑量為40.06%，補肺化瘀湯高劑量為51.41%。

觀察發現各組小鼠均精神狀態良好，補肺化瘀湯各治療組的體質量均與模型組無顯著差異，平穩緩慢增長；而陽性藥對照組小鼠體質量明顯低于模型組（P＜0.01），治療結束時，小鼠體質量輕微下降。補肺化瘀湯組、陽性藥對照組的心臟、肝臟、脾臟、肺及腎臟指數與模型組比較均無顯著性差異。

圖2 補肺化瘀湯對氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠腫瘤生長、臟器指數及體質量的影響Fig.2 Effects of Bufei Huayu Decoction on tumor growth，organ index and body mass of mice with Lewis lung cancer of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern

3.5 補肺化瘀湯對Lewis 肺癌氣虛血瘀證小鼠腫瘤組織凋亡的影響 如圖3 TUNEL 染色所示，模型組腫瘤細胞大小不等，表明其增殖迅速，且不穩定；而補肺化瘀湯高、中劑量組及陽性藥對照組中的腫瘤細胞脹大，且凋亡細胞百分比顯著增加。這說明了不同濃度的補肺化瘀湯可以誘導腫瘤組織發生不同程度的凋亡。

圖3 補肺化瘀湯對氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠組織凋亡的影響Fig.3 Effects of Bufei Huatan Decoction on tissue apoptosis of mice with Lewis lung cancer of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern

3.6 補肺化瘀湯對氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠腫瘤組織凋亡蛋白的影響 半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是一種胞漿蛋白水解酶，在細胞凋亡的過程中發揮著至關重要的作用［12］。凋亡是caspase 家族成員介導的蛋白酶級聯反應的過程，其中caspase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應分子，也是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，被稱為死亡執行蛋白酶［13-14］。caspase-9是線粒體凋亡途徑的效應蛋白，線粒體凋亡途徑被激活，細胞質中的caspase-9前體發生剪切，使其活化啟動caspase 級聯反應［15］。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白Bax，與線粒體膜通透性及線粒體膜電位的維持密切相關，在線粒體凋亡途徑中扮演著重要角色［15］。如圖4所示，與模型組比較，補肺化瘀湯能顯著促進cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax 蛋白表達（P＜0.01）；抑制Bcl-2蛋白表達（P＜0.01）。

圖4 補肺化瘀湯對氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠組織凋亡蛋白的影響Fig.4 Effects of Bufei Huayu Decoction on apoptosis protein of mice with Lewis lung cancer of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern

4 討論

氣虛血瘀證是臨床諸多疾病常見的中醫證候之一［6-7］。由于氣虛運血無力、血行瘀滯而表現的癥候，常由病久氣虛、漸致瘀血內停而引起。此外，氣虛血瘀證是晚期非小細胞肺癌的一個重要證型［16-17］。近年來，隨著生活方式的轉變加上工作節奏的加快，氣虛血瘀證在臨床上多見，并成為非小細胞肺癌的一個重要的標記及誘因［10-11，18］。非小細胞肺癌是嚴重威脅著人類生命健康的惡性腫瘤。目前，臨床上治療非小細胞肺癌通常使用細胞毒類抗腫瘤藥物，但是由于細胞毒類抗腫瘤藥物的選擇性較差，常引起危害患者健康的毒副反應。因此，尋找新的、高選擇性、無毒副作用的抗腫瘤藥物迫在眉睫。中藥復方是多成分混合體，作為外源性物質進入機體必然對內環境產生擾動，具有整體性和互助性原則。中醫認為“氣為血帥、血為氣母”“氣行則血行、氣滯則血瘀”，氣血之間相互依存、相互促進，在氣虛血瘀型中互為因果，補肺化瘀湯既有補氣的功效，又可活血，對氣虛血瘀證的高“濃、黏、凝、聚”狀態有顯著改善，因此補肺化瘀湯將有可能成為治療非小細胞肺癌的一種新的治療藥物［9，17，19-21］。

在本研究中，通過疲勞、驚恐、高脂飲食等刺激的小鼠出現倦怠嗜睡，精神萎頓，四肢蜷縮，活動性較差；毛發稀疏且易脫落，干燥枯黃且失去原有光澤；大部分小鼠出現了不同程度的腹瀉；尾部出現不同程度的皮下瘀紫或青斑等不同程度的氣虛血瘀證表型。統計氣虛血瘀小鼠和對照小鼠的體質量、運動時間及運動后排便量，發現氣虛血瘀證小鼠的體質量和運動時間均明顯低于對照小鼠，而運動后排變量卻顯著增加，這些癥狀分別對應了氣虛血瘀的消瘦、懶動和便溏癥狀。于此同時，臨床研究發現，氣虛血瘀證患者的血液均表現出“濃、黏、凝、聚”等改變，故將凝血指標的異常、血液流變學列為氣虛血瘀證的實驗室診斷標準［17，21-22］。通過疲勞、驚恐、高脂飲食等刺激方法，造模小鼠的高、中、低切變率，血漿黏度顯著地升高，而凝血功能（PT、APTT 和FIB）降低，表現出不同程度的“濃、黏、凝、聚”等氣虛血瘀證表型。灌胃給予不同劑量補肺化瘀湯后，造模小鼠的狀態隨著藥物濃度的增加逐漸恢復，精神狀態良好。此外，補肺化瘀湯呈濃度依賴性地降低造模小鼠的高、中、低切變率，血漿黏度。這表明了，補肺化瘀湯可以有效地逆轉通過疲勞、驚恐、高脂飲食等刺激方法引起的小鼠氣虛血瘀證表型。

大量文獻均表明，放、化療是通過誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤作用的［23-25］。為了考察補肺化瘀湯是否具有抗非小細胞肺癌的作用，建立了具有氣虛血瘀證的Lewis 肺癌小鼠，并通過TUNEL 染色考察補肺化瘀湯是否可以誘導腫瘤組織細胞發生凋亡。研究表明，補肺化瘀湯可以呈濃度依賴性地增加腫瘤組織中TUNEL 陽性細胞的百分比。此外，細胞凋亡是caspase 家族成員介導的蛋白酶級聯反應的過程，即在凋亡誘導信號的刺激下，啟動型的caspases 先被激活，發揮水解蛋白的作用，進而激活下游的效應型caspases，大范圍地降解細胞內蛋白，最終使細胞走向死亡［26-28］。蛋白免疫印跡檢測結果均表明，補肺化瘀湯能激活caspase 級聯反應的最終效應分子caspase-3。補肺化瘀湯是通過引起Lewis 肺癌小鼠腫瘤組織的凋亡而發揮抗腫瘤作用的。此外，在凋亡過程中，細胞內caspase 激活主要通過三條途徑：線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網應激途徑，這三條途徑都會激活caspase-3［24，28，30］。其中，線粒體途徑是凋亡的主要途徑，主要表現為線粒體受損，促使Cyto c 釋放到胞漿中，進而啟動caspase 激活，引起細胞凋亡的發生［24-25］。此外，在線粒體凋亡途徑激活中，Bcl-2家族成員扮演著重要的調節作用。其中，Bcl-2作為抗凋亡蛋白，Bax 作為促凋亡蛋白，可拮抗Bcl-2的抗凋亡作用，兩者的比值決定細胞走向生存還是死亡的命運［29-30］。本實驗結果顯示，補肺化瘀湯可以呈濃度依賴地引起小鼠移植瘤組織中促凋亡蛋白Bax 的顯著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的顯著下降。與此同時，補肺化瘀湯濃度依賴地引起線粒體凋亡途徑的效應蛋白caspase-9的增加。終上所述，補肺化瘀湯促Lewis 肺癌細胞凋亡作用是通過線路體凋亡途徑得以實現的。

綜上所述，補肺化瘀湯具有抗氣虛血瘀證小鼠的Lewis 肺癌作用，其機制是通過誘導腫瘤細胞通過線粒體凋亡途徑發生凋亡而實現的。本實驗不僅為補肺化瘀湯抗氣虛血瘀證小鼠的Lewis 肺癌的抗腫瘤機制提供了實驗依據，也為補肺化瘀湯早日應用于臨床治療非小細胞肺癌提供了理論依據。