眼絡通對兔視網膜靜脈阻塞相關生長因子表達的影響*

馮燕兵 熊 烈 曾子善 沈志新 朱潔云 徐 蘊 石彥波 翁文慶#

1浙江省嘉興市中醫醫院 浙江 嘉興314000 2浙江中醫藥大學 浙江 杭州310051 3江蘇省啟東市人民醫院 江蘇 啟東226200

視網膜靜脈阻塞（RVO）是一種常見的危害視功能的視網膜血管疾病。本研究旨在探討眼絡通方對RVO新西蘭兔視網膜組織血小板源性生長因子（PDGF）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）和色素上皮衍生因子（PEDF）mRNA表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組：清潔級健康實驗新西蘭兔66只，體重1.5～2.0kg，雄性，眼檢查無異常，購自嘉興學院動物實驗中心，實驗動物許可證號：SCXK（浙）2013-0056。將動物隨機分為6組：空白對照組6只，模型對照組、天保寧組、眼絡通低、中、高劑量組各12只。

1.2 實驗藥物及儀器：眼絡通顆粒方（葛根20g，川芎、地龍、三棱各10g，水蛭3g），由嘉興市中醫醫院藥劑科提供；天保寧（博普-益普生工業公司，批號：H2003122）；20%烏拉坦（嘉興學院提供）；逆轉錄試劑盒（Invitrogen，18080-051）；SYBR Green 熒光定量試劑盒（Thermo Fisher，A25742）；ABI 7500熒光定量PCR儀。

1.3 RVO 家兔模型的建立：健康新西蘭兔充分擴瞳，20%烏拉坦全身麻醉，拍攝無赤光眼底像，氬離子激光封閉兔視乳頭兩側髓翼血管系之主干靜脈（光凝斑直徑200～250μm，功率600～800mW，時間0.3～0.5s）。造模完成24h后作眼底血管造影檢查，驗證是否成功。

1.4 動物實驗給藥方法：術后24h 開始灌胃給藥，1次/天，連續給藥4周，參照體重劑量換算方法計算給藥量；空白對照組及模型對照組給予5ml/kg生理鹽水；天保寧組給藥劑量0.02g/kg；眼絡通低、中、高劑量組分別給藥劑量2.3g/kg、4.6g/kg、6.9g/kg。

1.5 取材及樣本保存：造模后連續灌胃給藥干預，分別在干預后的第1、2、4周，空氣處死，每次空白組2只，余組每組4只。及時摘除眼球，制成眼杯，分離取出視網膜組織，于液氮中快速冷凍后轉至-80℃冰箱保存。

1.6 RT-PCR 檢測VEGF、PDGF、PEDF mRNA 的表達：將總RNA逆轉錄為cDNA，為模板β-actin為內參進行熒光定量PCR 實驗，特異性引物序列見表1，熒光定量PCR 反應條件見表2。采用△△Ct 法計算各基因mRNA 的表達情況，倍增變化率=2-△△Ct（△△Ct=實驗組△Ct-空白對照組△Ct，△Ct=目的基因Ct-內參基因Ct）。

表1 特異性引物序列

表2 熒光定量PCR反應條件

1.7 統計學方法：使用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析，組間比較使用方差分析，兩兩比較使用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

VEGF 與PDGF 基因mRNA 表達量各組趨勢相似，見圖1。模型對照組在造模1、2、4周后，VEGF 與PDGF 基因mRNA表達量顯著高于空白對照組同期（均P＜0.05），且在第2周時表達量最高；VEGF 分別上調約860%、1530%、980%，PDGF 分別上調約830%、2690%、1040%。天保寧組較模型對照組除第4周VEGF 基因mRNA 表達量下調約20%外（P＜0.05），其余各點兩者表達量無顯著差異（均P＞0.05）。眼絡通各劑量組同一時間點隨給藥濃度的上升VEGF 與PDGF 基因mRNA 表達量逐漸下降，且眼絡通高劑量組的第2周高峰均消失。眼絡通高劑量組第1、2、4周VEGF 基因mRNA 表達量較模型對照組分別下調約60%、80%、70%（均P＜0.05）；PDGF 分別下調約60%、80%、60%（均P＜0.05），但二者各時間點表達量仍均顯著高于空白對照組（均P＜0.05）。

圖1 眼絡通方對RVO家兔視網膜VEGF（左）和PDGF（右）表達的影響

PEDF 基因mRNA 表達量呈相反趨勢，見圖2。模型對照組在造模1、2、4周后，PEDFmRNA 表達量分別下調約40%、30%、50%（均P＜0.05）。天保寧組較模型對照組分別上調約160%、180%、250%（均P＜0.05）。眼絡通各劑量組同一時間點隨給藥濃度上升，PEDFmRNA 表達量逐漸上升，且眼絡通高劑量組在第2周時出現高峰。眼絡通高劑量組各時間點PEDFmRNA 表達量較模型對照組分別上調約430%、780%、540%（均P＜0.05），且較空白對照組分別上調約190%、280%、190%（均P＜0.05）。

圖2 眼絡通方對RVO家兔視網膜PEDF表達的影響

3 討論

視網膜靜脈阻塞（RVO）屬于中醫學中“暴盲”范疇，病因、病機復雜多樣，其客觀結果皆為瘀血形成，以活血化瘀法為基本治法，眼絡通由葛根、川芎、地龍、三棱、水蛭五味中藥組成，全方共奏活血化瘀、破血消積之效[1]。

目前認為，VEGF、PDGF、PEDF在RVO新生血管形成中發揮重要作用。VEGF 是促進血管新生最重要的誘導因子；同為血管生成因子的PDGF 不僅能單獨促進新生血管生成，同時對VEGF 有促進作用，能顯著上調VEGF 表達[2]。PEDF 對VEGF、PDGF 表達也起到拮抗作用，抑制新生血管生成[3]。本研究發現，VEGF與PDGF基因mRNA相對表達量在模型對照組1周、2周、4周3個時相中表達皆高于空白對照組，這與既往研究中發現RVO 發生后，眼內VEGF 有較高表達這一結果相符[4]；與PDGF 在脈絡膜新生血管模型中呈現高表達[2]及BRVO 患者的房水中表達顯著增高[5]這一研究結果相符。對于各用藥組而言，天保寧組對RVO 新西蘭兔視網膜VEGF 與PDGF 基因表達影響較小，基本與模型對照組無差異；而眼絡通各劑量組隨著給藥濃度的上升，VEGF 與PDGF 基因表達量逐漸降低，且以眼絡通高劑量組表達量最低。值得注意的是，模型對照組中VEGF、PDGF 基因在第2周時表達量最高，我們猜測這可能與造模前新西蘭兔健康狀況良好，視網膜及血管自我修復能力強，造模后視網膜側支循環形成速度快有關。有研究表明，在鼠視網膜新生血管模型中PEDF 表達明顯下降[3]，本研究得到了相似的結果：模型對照組各時相PEDF 基因mRNA 表達低于空白對照組。眼絡通各劑量組PEDF 各時相表達量與VEGF、PDGF 呈負相關，且以眼絡通高劑量組上調最為明顯。

綜上所述，筆者發現在RVO 新西蘭兔視網膜組織中VEGF 與PDGF 基因的表達與眼絡通給藥劑量呈負相關，與PEDF 呈正相關。說明，上述3種因子可能是眼絡通治療RVO的作用靶點。本實驗為眼絡通方的臨床應用提供了有力的支撐。