柱前衍生-高效液相色譜法檢測測定沉香葉中γ-氨基丁酸的含量

張 健，陸穎珊，溫嘉倩，鄭秀榕，閆 沖 （廣東醫科大學，廣東東莞 523808）

γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid , GABA)是一種重要的中樞神經系統抑制性神經遞質，在谷氨酸脫羧酶(GAD)的作用下由谷氨酸脫羧生成，與突觸后膜的GABA受體結合而發揮作用。隨著研究技術的發展，越來越多的證據表明GABA系統異常與常見重性精神疾病如精神分裂癥、雙相障礙、重性抑郁障礙等密切相關[1]。另外，GABA擁有良好的水溶性和熱穩定性，以及食用安全性，并可用于飲料等食品的生產[2]。沉香葉為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Spreng的葉子。《中國藥典》(2015版)中記載：沉香行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘，用于胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急。相對于沉香而言，沉香葉的各種研究還處于起步階段，很多學者已經意識到曾經被當做廢料處理的沉香葉，其中所含的有效成分也有很大的開發利用價值[3]。有文獻報道沉香葉的乙醇提物具有鎮痛、抗炎、促進小腸運動、瀉下、止血、抗腦缺血缺氧、降血糖、抗腫瘤等活性[4]。沉香葉中黃酮類化合物有抗氧化活性[5]，但未見有文獻報道沉香葉含有GABA。因此，為進一步提高沉香樹的綜合利用價值，本實驗建立了沉香葉中GABA含量的HPLC測定方法。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，超純水設備(北京中科齊力科技公司)，JJ224 BC電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)，HH-1數顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)，TGL-16 G高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，PB-10標準型pH計(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。

1.2 試劑

GABA對照品購自上海源葉生物科技有限公司(LOT Z08A8H33553)；2, 4-二硝基氟苯購自上海麥克林生化科技有限公司。乙腈(acetonitrile)為色譜純；甲醇(CH3OH)、氫氧化鈉(NaOH)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)均為分析純。

1.3 材料

沉香葉摘于廣東醫科大學(東莞校區)藥用植物園，原植物經廣東醫科大學閆沖教授鑒定為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Spreng。

2 方法和結果

2.1 對照品溶液的制備

精確稱取GABA對照品適量，用超純水溶解，制成1 g/L的對照品溶液，精密量取一定質量濃度的GABA標準溶液1 mL于10 mL棕色瓶中，加入0.5 mol/L碳酸氫鈉(pH9.0)溶液1 mL，再分別加入1% 2,4-二硝基氟苯 (FDNB)乙腈溶液0.2 mL，置于60 ℃水浴鍋中避光加熱30 min后取出，冷卻，分別添加pH6.8的磷酸鹽緩沖液至10 mL，混勻，10 000 r/min離心15 min，經0.22 μm微孔過濾，作為對照品溶液[6]。

2.2 樣品溶液的制備

從不同沉香樹中隨機摘取沉香葉，混合后60 ℃烘干，打粉，過40目篩。稱取干燥沉香葉粉末5.00 g于錐形瓶中，加超純水約90 mL，95 ℃水浴加熱40 min，放冷后過濾，濾渣再用水洗滌后，合并濾液，定容至100 mL。

量取1 mL上述溶液置于10 mL棕色容量瓶中，加入0.5 mol/L碳酸氫鈉(pH9.0)溶液1 mL，再分別加入1% FDNB(2, 4-二硝基氟苯)乙腈溶液0.2 mL，置于60 ℃水浴鍋中避光加熱30 min后取出，冷卻至室溫，添加pH6.8磷酸鹽緩沖液至10 mL，混勻。取適量溶液至離心管中，10 000 r/min離心15 min，經0.22 μm微孔過濾，作為樣品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18 色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相A：V(乙腈)：V(超純水)=1:1，流動相B：pH=6.8的含有3%四氫呋喃的磷酸鹽緩沖液，A:B=35:65；檢測波長：360 nm；柱溫：27 ℃；流速：1.000 mL/min；進樣量：5 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 取濃度為0.01、0.02、0.06、0.08、0.1 g/L的GABA標準溶液，參照“2.1”方法進行衍生化反應，按照“2.2”色譜條件進樣檢測，以其峰面積為縱坐標(y, Au)，質量濃度為橫坐標(x,g/L)，繪制標準曲線。線性回歸方程為y=286.1x+3.57，r= 0.9994。

2.4.2 精密度試驗 取質量濃度為0.04 g/L的GABA對照品溶液，按“2.2”方法操作后，在“2.1”色譜條件下重復進樣6次，其峰面積RSD為0.89 %，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一批沉香葉樣品溶液，分別于配置2、4、8、12 h后按照2.2色譜條件進樣檢測GABA含量。GABA衍生物峰面積RSD為1.20 %，說明檢測物在12 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同批沉香葉樣品溶液，按樣品處理方法制備沉香葉樣品溶液5份，分別測定樣品溶液中GABA的含量，結果其峰面積RSD為2.50%，說明該實驗重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取5.00 g已知含量的沉香葉粉末9份，按表1分別加入GABA對照品溶液，按照樣品方法處理后，測定GABA含量，結果見表1。

2.5 樣品定性分析及含量測定

2.5.1 樣品定性分析 通過試驗多種流動相的比例，GABA對照品與樣品保留時間均一致，且二者的紫外吸收光譜特征也一致(掃描波長為200～400 nm)。對照品和樣品色譜圖見圖1。

2.5.2 樣品定量分析 取3批沉香葉粉末樣品及對照品溶液，外標法測定GABA含量，分別為0.3028、0.2815和0.3105 mg/g，平均0.2983 mg/g。

3 討論

本實驗首次建立了沉香葉中GABA含量的HPLC測定方法，重復性好，簡便快捷，為進一步的開發研究沉香葉的功能提供了基礎和依據。實驗結果表明沉香葉中含有一定量的GABA，3批沉香葉中GABA含量分別為0.3028、0.2815和0.3105 mg/g，說明沉香葉中含有的GABA具有很大的開發利用價值。

表1 方法的回收率實驗結果 (n=3)

圖1 GABA對照品(A)和沉香葉樣品(B)的高效液相色譜圖

除此之外，本實驗還探索了流動相pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0時各組峰的峰形及分離度，最終發現流動相pH為6.8時，GABA和其結構近似峰達到最好的分離度。在流動相pH為6.8時，流動相A和B的比例為35:65時，GABA保留時間控制在14 min以內，此時各組峰的峰形良好且能達到基線分離。