應用正交實驗優化扁藻胞外多糖硒化工藝的研究

劉梓茂 ，溫俊昊，潘榮華，魏文濱，黃永梅，羅 輝，吳斌華* （1.廣東醫科大學海洋醫藥研究院南海海洋生物醫藥資源研發公共服務平臺，廣東湛江 5403；.廣東醫科大學第一臨床醫學院，廣東湛江 5403；3.廣東醫科大學海洋藥用生物資源協同創新中心，廣東湛江 5403；4.廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東湛江 5403）

扁藻是一種重要的海洋微生物，人工培養的純凈高密度藻液包含著大量的胞外多糖[1]。研究發現，多糖類物質存在生物活性，擁有調節免疫細胞活性，抑制癌細胞生長等功能[2]。但天然多糖生物活性普遍較低，無法滿足藥用要求，且難溶于水，不易對其進行深入的藥理研究及其臨床制劑應用研究。因此需要對其進行化學結構修飾，其中將其硒化是一個較好的研究方向。硒是人體內必須的微量元素，發揮著抗氧化、保護細胞膜、提高機體免疫力、抵抗癌細胞以及消除重金屬積累等作用[3-5]。硒元素與扁藻胞外多糖以共價鍵方式相結合，可將無機硒元素轉化為有機硒。相較于無機硒，有機硒在人體內毒性更低，吸收率更高，可以被人體更好地吸收利用[6]。而經過硒化修飾的多糖可以更好地提高生物活性，如抗癌活性、免疫調節能力等。因影響硒化扁藻胞外多糖的產率和多糖硒含量的因素較復雜，本實驗通過制取純凈扁藻胞外多糖，并且以正交實驗對多糖硒化條件進行優化，以期為大規模制備硒化扁藻胞外多糖提供依據。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑

90-1磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；RE-5210A旋轉蒸發儀(上海榮生生化儀器廠)；JXN-300冷凍離心機(美國Beckman公司)；FD-1A-50冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)；KQ-100VDB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Epoch酶標儀(BioTek Instrument)；IRTracer-100傅立葉紅外吸收光度計(日本島津公司)；NexION 300X電感耦合等離子體質譜儀(美國Perkin Elmer公司)；500 Da透析袋(美國YTKH公司)等。

f/2培養基原液的制備參照Harrison等[7]的研究；Sevage溶液的制備參照劉佳維等[8]的研究。無水乙醇(AR，廣東光華科技股份有限公司)；亞硒酸鈉(Na2SeO3，純度為99%，上海新寶精細化工廠)；硝酸(廣東光華科技股份有限公司)和氯化鋇(廣東光華科技股份有限公司)；其他試劑均為市售分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 扁藻培養 本實驗扁藻來源于本實驗室保存的藻種[9]，采集于湛江硇洲島和徐聞珊瑚礁自然保護區潮間帶。大規模扁藻培養條件：f/2海水培養基；25、20 L無菌培養體系；以1 L/min的速度通入，經0.22 μm濾膜過濾空氣；每日光照16 h，黑暗處理8 h，磁力攪拌器以60 r/min模擬自然海浪環境。培養約30 d，即可進行扁藻胞外多糖提取。

1.2.2 提取扁藻胞外多糖 操作過程參考文獻[10]，并根據實驗情況進行改進。(1)藻液濃縮：扁藻藻液使用旋轉蒸發器，在45 ℃溫和條件下進行蒸發濃縮，大約濃縮到原體積1/10后停止。(2)藻體藻液分離：濃縮藻液在4 ℃、10 000 r/min條件下進行冷凍離心，分離胞外多糖溶液和藻體。隨后，在胞外多糖溶液中加入4倍體積無水乙醇進行醇析多糖，取得胞外多糖懸濁液。(3)多糖雜質去除：扁藻胞外多糖懸濁液在4 ℃、10 000 r/min條件下進行冷凍離心10 min，得到粗多糖沉淀后使用超純水進行復溶，去除不溶雜質。粗多糖水溶液使用截留分子量為500 Da的透析袋透析48 h去除氯化鈉，然后在多糖沉淀中加入1/3體積的Sevage溶液攪拌去蛋白后，分離去除Sevage溶液。(4)精多糖提取：使用4倍體積無水乙醇進行醇析，冷凍干燥多糖沉淀得到扁藻胞外多糖。

1.2.3 扁藻胞外多糖硒化反應正交實驗 我們選取了反應時間、硝酸質量分數、多糖/ 亞硒酸鈉和超聲功率等條件，采用正交實驗進行硒化設計[11-16]。具體為：(1)稱取1.0 g扁藻胞外多糖，加入100 mL硝酸溶液溶解，隨后加入1.0 g氯化鋇和對應質量亞硒酸鈉，充分攪拌溶解。(2)在溫度為60 ℃，對應超聲功率條件下進行反應，反應時間分別為6、8、10 h。(3)將反應完成體系用飽和NaHCO3溶液調節pH = 7，而后裝入截留分子量為1 000 Da透析袋中，透析 24 h 以上，直到透析袋外的水不再顯紅色為止，得到的溶液冷凍干燥，合成硒化扁藻胞外多糖。稱量，計算產率。硒化多糖產率=(硒化扁藻胞外多糖/扁藻胞外多糖)×100 %。配制成0.01%的多糖水溶液，使用電感耦合等離子體質譜儀定量測量硒元素質量，并計算硒化多糖硒元素含量。硒化多糖硒含量=(水溶液硒元素濃度×溶液體積)/(硒化多糖濃度×溶液體積)。

1.2.4 紫外吸光度檢測 采用Epoch酶標儀對扁藻胞外多糖和硒化扁藻胞外多糖進行220～800 nm紫外吸光度分析。

1.2.5 紅外吸光度檢測 采用傅立葉變換紅外光譜儀對扁藻胞外多糖和硒化多糖進行紅外吸光度掃描檢測。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件分析正交實驗結果。通過均方尋找各水平因素對多糖產率及多糖硒含量的影響，均方較大的因素為對該因變量影響較大的因素。通過權重系數法對硒化合成工藝進行優化處理。采用綜合評分法分別將多糖產率和多糖硒含量最高的積分設定為9分，以此為基數依次對9個實驗結果進行評分。將產率的權重系數設定為0.4，硒含量設定為0.6進行加權評分。Y=0.4 Y1+0.6 Y2(Y1為產率由高到低排序，Y2為硒含量由高到低排序)。

2 結果

2.1 扁藻胞外多糖提取率

扁藻大規模培養結束后，將扁藻藻液以低溫蒸餾以除去多余水分，在此過程中扁藻為抵御不良環境產生應激反應，分泌大量胞外多糖，平均產率為1.8 g/L。

2.2 以正交實驗優化扁藻胞外多糖硒化條件

2.2.1 正交實驗結果 選擇反應時間、硝酸質量分數、多糖/亞硒酸鈉、超聲功率，按 L9(34)正交表進行設計。實驗結果見表1。

表1 正交實驗設計及結果

2.2.2 影響因素的方差分析 影響多糖產率和多糖含硒量的主要因素是超聲功率和反應時間，硝酸質量分數和亞硒酸鈉含量為次要條件。詳見表2。

表2 方差分析表

2.2.3 根據權重評分確定最佳工藝 第4組權重評分最高。最佳反應條件如下：反應時間為8 h，硝酸質量分數為3%，多糖和亞硒酸鈉的質量比為1 : 1.2，超聲功率為70 W。

2.3 紫外吸光度檢測結果

紫外吸光度顯示在280 nm處無吸收峰，樣品中無蛋白質物質，詳見圖1和圖2。

圖1 扁藻胞外多糖紫外吸收掃描

圖2 硒化扁藻胞外多糖紫外吸收掃描

2.4 紅外吸光度檢測結果

從圖3可以看出，在3 421.72、1 624.06、1 141.86和1 011.03 cm-1處均存在吸收峰，分別為-OH、C=O、C-O和C-O-C特征吸收峰。圖4中可見3 421.72、1 114.86、1 076.28和983.70 cm-1處均有吸收峰，分別為-OH、C-O、Se=O和Se-O特征吸收峰，在743 cm-1和453 cm-1處無亞硒酸鈉的特征吸收峰。

圖3 扁藻胞外多糖紅外吸收光譜

圖4 硒化扁藻胞外多糖紅外掃描結果

3 討論

本次研究提供了一種生產、提取扁藻胞外多糖，并將其硒化的優化方案。該方案能夠在無菌狀態下大量培養扁藻，提純扁藻胞外多糖，多糖提取率比相關文獻高[17]，平均產率高達1.8 g/L，考慮是由于在提取過程中運用了低溫蒸餾濃縮扁藻藻液，引起了扁藻的應激反應，從而誘導扁藻產生了大量的胞外多糖。

通過對扁藻胞外多糖的紫外吸光度進行檢測，我們并沒有在280 nm處檢測到吸收峰，此處為含苯環蛋白質的特征吸收峰，證明本實驗成功去除了蛋白雜質。紅外吸光度掃描顯示多糖存在-OH、C=O、C-O、C-O-C 的吸收峰，其中C=O證明含有醛基，C-O-C是吡喃型糖的特征吸收峰，因此可以證明該多糖為吡喃型多糖。

多糖硒化修飾步驟中，影響硒化結果的因素較多，如亞硒酸鈉與多糖的質量比、催化劑質量、溫度、硝酸質量分數、超聲頻率、反應時間等。參考相關文獻[11-16]，我們選取4個影響程度較大的因素(硝酸質量分數、超聲頻率、反應時間和亞硒酸鈉與多糖質量比)進行正交設計，通過綜合評分法選取最佳硒化反應條件。因多糖硒含量直接與其生物活性的高低有直接關系，故其權重應高于多糖產率，參考林雪燕等[14]的研究，將產率的權重系數設定為0.4，硒含量設定為0.6，進行加權評分，突出硒含量在工藝評定中的重要性，以此得到的最佳制備工藝：反應時間為8 h，硝酸質量分數為3%，多糖和亞硒酸鈉的質量比為1 : 1.2，超聲功率為70 W。影響硒化多糖產率和產物中硒含量的因素由大到小依次為：超聲功率、反應時間、亞硒酸鈉含量、硝酸質量分數。與其他硒化多糖實驗比較[15-16]，本實驗硒化多糖產率和硒化率均有所提高，特別是在最佳制備條件下差別最為明顯，可能是因為本實驗中引進了超聲，有利于促進硒元素和多糖的結合，使硒化率明顯提高。

將硒化扁藻胞外多糖再次進行紅外吸光度掃描，我們發現上述的吡喃型多糖特征吸收峰仍然存在，證明其結構依然保留。其中-OH 特征吸收峰有所下降，可能是其被硒化基團替代所致，而C=O特征吸收峰較未硒化多糖弱，可能是由于硒化基團取代了羰基或者硝酸破壞了其固有的結構。Se=O和Se-O為新出現的特征吸收峰，由于樣品經過透析除去原料中的亞硒酸鈉，此處出現的硒化基團特征吸收峰排除了原料的影響，表明多糖化學修飾成功完成，硒元素是通過共價鍵的方式與硒化多糖連接的。

本次研究主要探索了硒化扁藻多糖的最佳硒化工藝，同時對其結構進行了初步分析，所獲得的扁藻胞外多糖以及硒化扁藻胞外多糖可應用于隨后的功能研究。