Phb2/REA過表達慢病毒載體對體外Th17分化條件下小鼠單核細胞IL-17a表達的影響

譚卉卉，林燦輝，李街青，陳佳玲，史建強*，陳嶸祎,*，劉 勝波（.廣東醫科大學，廣東 湛江 5403；.廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江 5400）

國內外大量研究表明IL-17可參與系統性紅斑狼瘡(SLE)、銀屑病、類風濕性關節炎、腦脊髓炎等多種自身免疫性疾病的發病環節[1-4]，也可以通過誘導炎癥介質及趨化因子的產生而導致機體組織器官的損傷。我們的前期研究發現，雌二醇(E2)與ER結合后可以募集雌激素活性抑制因子(REA)，作用于維甲酸依賴性孤核受體γt(ROR-γt)啟動子區域的雌激素反應元件(ERE)，抑制ROR-γt的表達，從而抑制Th17分化[5]。但E2有抑制炎癥和促進炎癥的雙重作用，不但可以通過上調REA、抑制RORγt表達以遏制Th17細胞的分化，還可促進Th2細胞及漿細胞分化分泌自身免疫性抗體，參與SLE發病，因此不能直接采用E2治療SLE。抑制素2(PHB2)是蛋白抑制素家族中的一員[6]，可選擇性地抑制ER的轉錄活性，有效抑制Th17細胞分化及IL-17表達。由于REA-慢病毒過表達技術能夠穩定表達REA，因此我們通過該項技術上調REA的表達、抑制Th17細胞的分化，進而減少IL-17的分泌，以期驗證該方法治療SLE的可行性。

1 材料和方法

1.1 Phb2過表達慢病毒載體

慢病毒載體的構建、合成、測試均由上海吉凱基因化學技術有限公司提供，本實驗最終所制備的GV358-Phb2過表達慢病毒載體元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。陰性對照病毒CON248(對應目的病毒)元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP。

1.2 小鼠脾臟T淋巴細胞的分離和純化

頸椎脫臼法處死C57/BL6J小鼠后置于75%酒精溶液中浸泡2 min，超凈工作臺(SW-CJ-2FD蘇凈安泰)中取出小鼠脾臟，置于盛有PBS(20012-043)的培養皿(60 mm)中；剔除脾臟以外多余的脂肪組織，并予PBS漂洗2次；剪碎脾臟，用磨砂玻片輕輕研磨至組織發白，再將研磨液轉移至細胞篩(70 μm)中過濾，獲得細胞懸濁液，混合均勻后用吸管將細胞懸液轉移至盛有小鼠淋巴細胞分離液的離心管中(注意不要將分離液粘在管壁上)，使細胞懸濁液懸于淋巴細胞分離液上，再將懸液以500 r/min離心30 min，吸取從上數第二層懸液至新的離心管中，并予PBS重懸，吹打混勻，以320 r/min離心5 min，棄上清，加2 mL紅細胞裂解液(PBS : 紅細胞裂解液=4 : 1)，用吸管伸至離心管底部吹打混勻5 min后再加8 mL PBS終止裂解反應，再次吹打混勻，以320 r/min 離心5 min，棄上清。再次加入PBS液清洗1遍，棄上清，予PBS重懸。采用免疫磁珠法分離純化T淋巴細胞[6]，最后加入1 mL(FBS+RPMI-1640)培養基重懸，細胞計數，鑒定細胞活力。

1.3 慢病毒轉染淋巴細胞

實驗設立5個組：空白組、空載體組、慢病毒組、Th17分化組和Th17+慢病毒組。每皿加入2 mL培養基并接種1×107個淋巴細胞，置37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養30 min。按照預實驗所得的細胞最適MOI(multiplicity of infection) 值為10，計算出所需要的病毒體積[病毒體積=(MOI×細胞數)/病毒滴度]；空載體組加入不含目的基因的病毒液；慢病毒組加入病毒液，置37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養14 h后，將其分別轉移至5支15 mL離心管中，以300 r/min 離心 5 min后棄上清，予4 mL常規培養液重懸，如表1分別加入刺激因子。提前2 h以anti-CD1=3ε(2 mg/L，Biolegend，Cat.100314) 分別覆蓋6個直徑6 cm的培養皿中，37 ℃ 孵化2 h，再予PBS漂洗2次備用。將加入上述刺激因子的重懸液分別轉移到備用的培養皿中，培養72 h后收集細胞，詳細過程可參考文獻[8]，于熒光顯微鏡下觀察并測定轉染效率，最后提取RNA行Realtime-PCR檢測。

1.4 RT-qPCR檢測

收集上述5組細胞，使用RNeasy Mini kit (QIAGEN，Cat.74106) 提取細胞RNA，用iScript cDNA合成試劑盒(BIO-RAD，Cat.170-8891)進行逆轉錄，加入iQ SYBR Green Supermix DNA聚合酶混合物(BIORAD，Cat.170-8882)后，使用Master Cycler Gradient PCR儀(擴增條件為95 ℃ 30 s預變性→95 ℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環→熒光融解得到融解曲線)檢測REA、IL-17a、RORγt、GAPDH的mRNA表達情況。REA、IL-17a、RORγt、GAPDH引物序列見表2。

表1 5組細胞的處理方法

表2 REA、IL-17a、RORγt、GAPDH引物序列

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件分析數據。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析和Dunnett’s T3檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Phb2/REA慢病毒轉染小鼠淋巴細胞

熒光表達約80%，細胞生長良好，REA過表達慢病毒轉染成功，見圖1。

圖1 病毒轉染后72 h熒光圖

2.2 RT-qPCR檢測

Th17+慢病毒組的REA、RORγt mRNA表達較慢病毒組高，且慢病毒組、Th17+慢病毒組REA、RORγt的mRNA明顯高于Th17分化組，差異均有統計學意義(P<0.05或0.01)；空載體組與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2、3。Th17分化組的IL-17A mRNA表達明顯上調(P<0.01)，且高于Th17+慢病毒組(P<0.01)；空白組、空載體組、慢病毒組的IL-17A mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

圖2 細胞培養72 h后REA的mRNA 表達情況

圖3 細胞培養72 h后RORγt的mRNA表達情況

圖4 細胞培養72 h后 IL-17a 的mRNA表達情況

3 討論

Th17細胞是2005年發現的T細胞亞群，以選擇性分泌細胞因子IL-17為特征[8]，其特異性轉錄調控因子主要是RORγt[10-11]。Th17細胞的分化過程不同于Th1和Th2。當機體遭受病原體時，其先合成IL-6和TGFβ，繼而誘導T細胞表達轉錄因子RORγt，調控Th17細胞的分化。而IL-23既可以誘導IL-17的產生，與受體結合后也可以啟動JAK-STAT信號通路，促進Th17細胞成熟[1,12]。

E2參與細胞免疫和體液免疫的調節及抗原的呈遞，在抑制炎癥的同時也能促進炎癥的發生。E2可以通過上調REA募集HDAC1、HDAC2的方式抑制RORγt的表達[13]，遏制Th17細胞分化。其過程可能是通過抑制IL-17的分泌，亦可能是通過促進Th2細胞的分化參與SLE的發病，因此不能直接采用E2治療SLE。

我們預期采用Phb2(REA)慢病毒過表達技術促進REA表達，從而下調RORγt抑制Th17細胞的分化，探討治療SLE的可行性。結果發現，Th17+慢病毒組REA和RORγt的mRNA表達較慢病毒組高，且慢病毒組和Th17+慢病毒組REA和RORγt的mRNA明顯高于TH17分化組，空載體組與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)。TH17分化組IL-17A的mRNA表達明顯上調(P<0.01)，且TH17分化組IL-17的mRNA表達明顯高于Th17+慢病毒組(P<0.01)。實驗結果顯示REA上調的同時RORγt也上調，但Phb2(REA)慢病毒過表達載體在Th17分化條件下可明顯抑制IL-17A表達，表明Th17細胞的分化過程受到了抑制。雖然這一機制與E2通過RORγt抑制Th17的分化不同，但該方法卻能有效抑制IL-17A的表達，提示Phb2(REA)慢病毒過表達載體有望成為治療Th17細胞免疫紊亂相關性疾病如SLE、銀屑病等的新方案。我們推測Phb2(REA)慢病毒過表達載體未能抑制RORγt的原因可能與細胞對REA高表達的反應性，即反饋性上調RORγt的表達有關。由于實驗只是初步探討了Phb2/REA過表達慢病毒載體對Th17細胞分化的影響，至于慢病毒是通過何種途徑參與抑制Th17細胞的分化過程，其具體影響機制有待我們進一步研究。