普境安對類似非洲豬瘟病毒的高接觸性傳染病病毒殺滅效果評估

普境安說明：“普境安”主要成分為磷酸鹽化合物（85%）、鈣、鐵、硫酸鹽（2.6%）、活性氯、Perica 油（0.05%）和鋁硅酸鹽（10.1%）。“普境安”具有很強地降低病毒滴度，還可以降低大量細菌作用。減少微生物吸附造成的對表面微生物污染的作用，吸附地板上的水和尿素，減少氮排放，稍微的防臭作用使“普境安”適合用作很好的衛生材料。

評價目的：偽狂犬病病毒和禽痘病毒與非洲豬瘟病毒的分子結構相似，都是雙股DNA 病毒，并且同是高接觸性傳染病，評價“普境安”體外降低偽狂犬病病毒、禽痘病毒活性效果的同時也為“普境安”降低非洲豬瘟病毒的活性提供有力依據。

評價方法：將“普境安”消毒劑設置梯度使用劑量（1/2 推薦劑量、推薦劑量、2×推薦劑量）在不同溫度（4 ℃、16 ℃、37 ℃）、不同時間（5 min、15 min、30 min、45 min）、不同環境和偽狂犬病病毒（PRV）、禽痘病毒（FPV）分別作用后測病毒TCID50，抽提核酸后用熒光定量PCR 方法檢測病毒核酸含量，觀察“普境安”對偽狂犬病病毒和禽痘病毒的吸附效果。模擬消毒劑使用的現場環境（土壤、水泥地、糞便）和偽狂犬病病毒、禽痘病毒分別混合后再使用“普境安”干粉消毒劑作用，分別設置3 個變量（劑量、溫度、時間）檢測不同情況下“普境安”干粉消毒劑吸附病毒、降低病毒活性的作用。

本試驗于2019年6 月在四川農業大學動物醫學院動物生物技術中心完成

1 主要試劑及實驗動物

1.1 毒株

豬偽狂犬病病毒（PRV-XJ），保存于四川農業大學動物生物技術中心；禽痘病毒毒株，保存于四川農業大學動物生物技術中心。

1.2 主要試劑

胎牛血清、細胞培養液（DMEM 培養液）、胰蛋白酶、PBS緩沖液、PK-15 細胞，雞胚成纖維細胞，熒光PCR 引物，均由實驗室提供；“普境安”消毒劑由丹麥（Storm?llen 公司）、成都杰鑫瑪生物科技有限公司生產提供。

2 消毒劑安全評估結果

2.1 偽狂犬病病毒和禽痘病毒滴度測定

2.1.1 病毒液制備

將偽狂犬病病毒液和禽痘病毒液按常規操作分別接種于生長良好的PK15 細胞和雞胚成纖維細胞，37 ℃、5% CO2條件下培養，當病毒發生70%～80%感染時，將病毒液反復凍融 2 ～3 次，收集病毒液離心取上清，分裝于2 mL EP 管中。

2.1.2 測定偽狂犬病病毒和禽痘病毒的 TCID50

取上述制備好的病毒懸液用無血清的DMEM 細胞培養液進行10系列的稀釋（10-1～10-10），分別接種于長滿單層PK-15 細胞和雞胚成纖維細胞的96 孔培養板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100 μL 的病毒懸液；用含2% PBS的DMEM 細胞培養液作為對照，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養，觀察細胞有無細胞病變（CPE）變化并記錄結果。按Reed-Muench 法計算病毒的TCID50。

2.1.3 偽狂犬病病毒和禽痘病毒滴度測定結果

病毒滅活滴度用半數細胞感染劑量（TCID50）表示。計算公式如下：

TCID50對數值=病變率高于 50%組稀釋度的對數值+距離比例（“病變率高于 50%組”是指病變率超過 50%的最低組，下面均簡稱“高于 50%組”；“病變率低于 50%組”是指病變率低于 50%的最高組，下面均簡稱“低于50%組”）。

表1 偽狂犬病毒滴度測定結果

表 2 禽痘病毒滴度測定結果

根據表1 和表2 中結果，按Reed-Muend 法計算出偽狂犬病病毒的TCID50值為10-8.21/0.1 mL ,禽痘病毒的TCID50值為10-6.73/0.025 mL。

2.2 “普境安”消毒劑接觸時間對禽痘病毒和偽狂犬病病毒體外殺滅效果測試

取288 個無菌培養皿，一半培養皿（108 個試驗組+36 個對照組）涂1 mL 禽痘病毒液，另一半培養皿（108 個試驗組＋36 個對照組）涂1 mL 偽狂犬病病毒液后放于 37℃無菌恒溫箱干燥。向已干燥的病毒培養皿中以 25 g/m2，50 g/m2，100g/m2劑量加入粉劑“普境安”，在 4℃、16℃、37℃條件下使消毒劑單獨與等份的病毒保持接觸5 min，15 min，30 min，45 min（試驗組每組設置3 組重復，最后取平均值，不同溫度下不同時間設置空白對照組無消毒劑作用也做3 組重復）。后將“普境安”干粉移除，用1 mL DMEM 細胞培養液重懸收集培養皿中的病毒，做梯度稀釋后測定試驗組與對照組的TCID50對比病毒滴度的差異。

試驗結果表明（見表3），“普境安”粉狀消毒劑受溫度的影響較小，在不同的濃度和環境溫度下對病毒均有很好的殺滅作用，在接觸15 min 后滴度減少平均達到4 以上，在作用30 min 后滴度減少平均達到5 以上，但在推薦劑量時殺滅效果最佳。

2.3 熒光定量檢測“普境安”對禽痘病毒和偽狂犬病病毒體吸附效果

取288 個無菌培養皿，一半培養皿（108 個試驗組＋36 個對照組）涂1 mL 禽痘病毒液，另一半培養皿（108 個試驗組+36 個對照組）涂1 mL 偽狂犬病病毒液后放于37 ℃無菌恒溫箱干燥。向已干燥的病毒培養皿中以 25 g/m2，50 g/m2，100g/m2劑量加入粉劑“普境安”，在4 ℃、16 ℃、37 ℃條件下使消毒劑單獨與等份的病毒保 持 接 觸 5 min，15 min，30 min，45 min（試驗組每組設置3 組重復，最后取平均值，不同溫度下不同時間設置空白對照組無消毒劑作用也做3 組重復）。后將“普境安”干粉移除，用1 mL DMEM 細胞培養液重新懸浮收集培養皿中的干燥病毒，抽提病毒DNA，檢測DNA 濃度。梯度稀釋的標準品（即病毒原液）及待測樣品進行實時定量PCR檢測，用標準品制作標準曲線，檢測對照組和試驗組病毒核酸含量，對比差異。

試驗結果表明（見表4），“普境安”粉狀消毒劑可在不同溫度和濃度下均可有效吸附環境中的病毒，在移除普境安粉末的同時能移除大量病毒，其受溫度影響較小，推薦劑量在接觸15min 以上能大幅降低病毒量，達到較好的清除效果。

2.4 “普境安”消毒劑在土壤環境中對病毒的吸附效果

試驗設置 A、B 組，每組3個重復，A 為偽狂犬病病毒組：5×5×5 cm3的土壤中加 2 mL 偽狂犬病病毒原液；B 為禽痘病毒組：5×5×5 cm3的土壤中加 2 mL 禽痘病毒原液，同樣在不同溫度不同時間下設置空白對照組無消毒劑作用也做3 組重復。每組分別設置4 ℃、16 ℃、37 ℃3 個溫度梯度，每個溫度下以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2的量加入粉劑“普境安”，作用 5 min、15 min、30 min、45 min 后用生理鹽水將土壤溶解，4 000 r/min 離心5 min 取上清，然后將上清做梯度稀釋檢測病毒滴度，對比消毒劑處理前后病毒滴度的差異。

表 3 “普境安”對禽痘病毒和偽狂犬病毒作用后TCID50 結果

表 4 “普境安”對禽痘病毒和偽狂犬病病毒作用后熒光定量試驗結果

試驗結果表明（見表5），在土壤環境中，“普境安”粉狀消毒劑在不同溫度差異較小，在不同的濃度和環境溫度下對病毒均有很好的殺滅作用，在接觸5 min 后大幅度降低病毒滴度，在接觸15 min 后病毒滴度平均降低4 以上。

2.5 “普境安”消毒劑對糞便環境中病毒的吸附效果

試驗設置 A、B 組，每組3個重復，A 為偽狂犬病病毒組：5×5×5 cm3糞 便 加 2 mL PRV病毒原液；B 為禽痘病毒組：5×5×5 cm3糞 便 加2 mL FPV 病毒原液，同樣在不同溫度不同時間下設置空白對照組無消毒劑作用也做3 組重復。每組分別設置 4 ℃、16 ℃、37 ℃3 個溫度梯度，每個溫度下以25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2的量加入粉劑“普境安”，作用5 min、15 min、30 min、45 min 后 用 生 理鹽水將土壤溶解，4 000 r/min 離心5 min 取上清，然后將上清做梯度稀釋檢測病毒滴度，對比消毒劑處理前后病毒滴度的差異。

試驗結果表明（見表6），在糞便環境中，“普境安”粉狀消毒劑在不同溫度差異較小，在不同的濃度和環境溫度下對病毒均有很好的殺滅作用，在接觸15 min 后病毒滴度平均降低4 以上。

表 5 土壤環境試驗 TCID50 結果

表 6 糞便環境試驗 TCID50 結果

2.6 “普境安”消毒劑對水泥地面環境中病毒的吸附效果

試驗設置A、B 組，每組3個重復，A 為偽狂犬病病毒組：100 cm2的水泥地面上加 2 mL PRV病毒原液；B 為禽痘病毒組：100 cm2的水泥地面加2 mL FPV 病毒原液，同樣在不同溫度不同時間下設置空白對照組無消毒劑作用也做3 組重復。待病毒液干后，每組分別設置4 ℃、16 ℃、37 ℃3 個溫度梯度，每個溫度下以25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2的量加入粉劑“普境安”，作用5 min、15 min、30min、45 min 后移除“普境安”，用生理鹽水沖洗地面后將其收集。然后做梯度稀釋檢測病毒滴度，對比消毒劑處理前后病毒滴度的差異。

試驗結果表明（見表7），在水泥地面環境中，“普境安”粉狀消毒劑在不同溫度差異較小，在不同的濃度和環境溫度下對病毒均有很好的殺滅作用，在接觸15min 后病毒滴度平均降低4 以上。

表 7水泥地面環境下試驗 TCID50 結果

3 評價情況總結

結果顯示“普境安”消毒劑對偽狂犬病病毒和禽痘病毒有很好的滅活作用，不同溫度對其滅活作用影響不大，建議使用推薦劑量。模擬消毒劑使用的現場環境試驗中“普境安”對兩種病毒都有很好的滅活效果，可以為其使用提供參考依據。

綜合評定認為“普境安”消毒劑對環境中病毒有很好的滅活作用，可以用于生產消毒。