某規(guī)模化豬場(chǎng)類NADC30 、HP-PRRSV、PRRSV 與大腸桿菌混合感染的診斷與防治

申歡歡，陽(yáng)愛國(guó)，陳弟師，顏其貴

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)也稱豬藍(lán)耳病，是由動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬的豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種嚴(yán)重的病毒性傳染病。該病以引起母豬的繁殖障礙、仔豬和育成豬呼吸道癥狀及高死亡率為主要特征[1，2]。本病曾經(jīng)在歐洲的德國(guó)、荷蘭、西班牙、比利時(shí)、英國(guó)、法國(guó)，美洲的墨西哥、智利，亞洲的韓國(guó)、日本都發(fā)生過，僅美國(guó)2005-2010 年P(guān)RRS 就 造 成 了6.64 億美元的損失，嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[3，4]。在中國(guó)，由于對(duì)該病的認(rèn)識(shí)和防控不到位，病毒與豬體之間的相互作用促進(jìn)了病毒變異，導(dǎo)致了自2006 年以來暴發(fā)高致病性藍(lán)耳病（HPPRRSV），HP-PRRSV 的NSP2 區(qū)出現(xiàn)30 個(gè)AA 缺失，gp5 區(qū)域也發(fā)生了變異，對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成很大損失，但是有研究表明NSP2 區(qū)域的缺失并不是豬高致病性藍(lán)耳病毒力增強(qiáng)的根本原因[5，6]；自2013 年起我國(guó)出現(xiàn)變異株NADC30-like-PRRSV(NADC30)，NADC30 NSP2 區(qū) 域 出 現(xiàn)131 個(gè)AA缺失，gp5 區(qū)域也發(fā)生了變異[7,8]，進(jìn)一步加重了PRRSV 的危害，該病有可能為輸入性疾病[9，10]。NADC30 毒株與高致病性藍(lán)耳病毒株和普通藍(lán)耳病相比，在基因組學(xué)和臨床致病性等方面均呈現(xiàn)出明顯差異，揭示了我國(guó)PRRSV 流行毒株出現(xiàn)了新的變異類型，更加加重了PRRSV 的危害[11]。

1 發(fā)病情況

豬場(chǎng)有繁殖母豬1 000 余頭，分別于2017 年9 月份和12 月份出現(xiàn)一定量的母豬流產(chǎn)。流產(chǎn)前幾天母豬體溫升高，食欲減退或不食，部分母豬有呼吸癥狀，腹部和耳部發(fā)紺，流產(chǎn)胎兒多數(shù)為死胎，胎兒大小一致無木乃伊胎，少數(shù)活仔豬大部分于6 d 內(nèi)死亡。

2 病理解剖

病理解剖可見仔豬頜下淋巴結(jié)，腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)腫大有出血，心包有積液，心冠變軟，肺部組織實(shí)質(zhì)性肉變，肺部病例切片顯示為典型間質(zhì)性肺炎（圖1）。擠壓肺部切面會(huì)出現(xiàn)泡沫，腎臟有出血點(diǎn)。

3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

3.1 PCR 檢測(cè)

根據(jù)發(fā)病情況和免疫程序首先考慮對(duì)豬場(chǎng)病料進(jìn)行豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的檢測(cè)。應(yīng)用Primer 5.0探針對(duì)NADC30(GenBank: KP860909.1)，JAX1（GenBank:EF112445.1）和CH-1a（GenBank:EF112445.1）為參考序列設(shè)計(jì)可同時(shí)鑒別NADC30，HP-PRRSV和PRRSV的引物PRRSV-F/R，PRRSV目的條帶約1 020 bp；HP-PRRSV目的條帶約940 bp；NADC30目的條帶約6 3 0 b p（P R R S V-F：TTTTGGACACCTCCTTTGATTG；PRRSV-R：TCTACGCTTGACAGG GAGCTGCTT）。PRV的檢測(cè)使用國(guó)標(biāo)引物PRV-F/R，目的條帶約220 bp（PRV-F: CAGGAGGACGAG CTGGGGCT; PRV-R: GTCCACGCC CCGCTTGAAGCT）。取疑似發(fā)病豬只心，肝臟，脾，肺和腎等組織做勻漿處理；12 000 r/min離心5 min收集勻漿上清液；參照美基生物病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書提取病料DNA/RNA，50 μL Nuclease free water 溶解核酸。取1 μL核酸參照TAKALA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為CDNA。PRRSV 10 μL檢測(cè)體系：0.5 μL CDNA, 10 nmol/L上下游引物各1 μL，7.5 μL Nuclease free water。擴(kuò)增條件為：98 ℃ 2 min, 98 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s（35循環(huán)），72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物5 μL用 1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定（圖2）。PRV 10 μL檢測(cè)體系：0.5 μL DNA,10 n mol/L上下游引物各1 μL，7.5 μL Nuclease free water。擴(kuò)增條件為：98 ℃ 2 min,98 ℃ 10 s,56 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s（35循環(huán)），72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物5 μL用 1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定。

3.2 細(xì)菌檢測(cè)

3.2.1 細(xì)菌分離鑒定

無菌操作取發(fā)病豬心、肝、腎、脾等組織接種于含5%胎牛血清的胰蛋白大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)36 h 可見直徑為1.5 mm 的圓形，光滑，表面濕潤(rùn)，銀灰色的菌落。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色和油鏡下觀察，細(xì)菌形態(tài)為短桿菌，長(zhǎng)約1 ～3 μm(圖3)。對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定：分離細(xì)菌對(duì)硫化氫、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、黏液酸（鹽）、賴氨酸、鳥氨酸等反應(yīng)管呈陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)呈陽(yáng)性；VP 試驗(yàn)陰性和枸櫞酸鹽利用呈陰性。生化鑒定結(jié)果符合大腸桿菌的特征[12]。

圖1 肺部病理切片

圖2 PRRSV 檢測(cè)

圖3 細(xì)菌鏡檢

4 分析討論

通過流行病學(xué)、剖檢結(jié)果和PCR 檢測(cè)可以初步判定該豬場(chǎng)為PRRSV、HP-PRRSV、NADC30 混合感染。該豬場(chǎng)24 個(gè)月前免疫過HPPRRS 疫苗，但是母豬流產(chǎn)情況并沒有得到很大的改善。也有報(bào)道免疫PRRS 后導(dǎo)致豬群感染PRRSV，這也是許多豬場(chǎng)做PRRS 免疫時(shí)的憂慮[13]。該規(guī)模化豬場(chǎng)發(fā)病豬體表發(fā)紅，有的出現(xiàn)體溫升高的情況；母豬流產(chǎn)胎兒大小差異不大，無木乃伊胎；剖檢可見淋巴結(jié)腫大有出血，肺部呈現(xiàn)典型間質(zhì)性肺炎；腎臟有出血點(diǎn)；心包有積液但無纖維滲出。綜合以上情況初步判定可能會(huì)存在PRRSV 的感染。根據(jù)該豬場(chǎng)和NADC30 流行情況運(yùn)用Primer 5.0 設(shè)計(jì)可同時(shí)擴(kuò)增PRRSV 、HP-PRRSV、NADC30 引物；PCR 結(jié)果出現(xiàn)3 條帶大小分別為：1 020 bp、940 bp、620 bp。針對(duì)母豬流產(chǎn)情況研究室檢測(cè)了PRV 和PRRSV。檢測(cè)結(jié)果證實(shí)此規(guī)模化豬場(chǎng)存在PRRSV 、HPPRRSV、NADC30 混合感染，無PRV的感染。實(shí)驗(yàn)室臟器細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果顯示為大腸桿菌感染。該規(guī)模化豬場(chǎng)小規(guī)模流產(chǎn)診斷為：以PRRSV 、HP-PRRSV、NADC30 混合感染為主因所導(dǎo)致。

5 防治

針對(duì)病死豬深埋無害化處理，對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行全面消毒，生活區(qū)與生產(chǎn)區(qū)分開，進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)前要洗澡換鞋，每棟豬舍前放置消毒燒堿水，盡量減少非必要人員和物料接觸。對(duì)引進(jìn)后備豬進(jìn)行隔離檢疫；對(duì)患病豬只進(jìn)行隔離并檢測(cè)豬體情況，進(jìn)行帶豬消毒；豬舍用消毒液消毒每周兩次常態(tài)化進(jìn)行；加強(qiáng)豬舍通風(fēng)和科學(xué)飼養(yǎng)管理；優(yōu)化免疫程序并監(jiān)測(cè)豬群整體狀態(tài)；及時(shí)淘汰老弱母豬。仔豬哺乳前用0.1%的高錳酸鉀擦洗母豬腹部；注意仔豬保溫和清潔。針對(duì)大腸桿菌感染于分娩前2 d 注射氧氟沙星預(yù)防處理；每天早晚各1 次。保持哺乳舍的干燥和清潔，保證仔豬保溫和干燥，可以提供保溫箱或者電熱毯。