綜述非洲豬瘟病毒

劉穎昳（編譯）

（中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600）

1 簡(jiǎn)介

非洲豬瘟是一種豬的病毒性疾病，可導(dǎo)致家豬的高死亡率，同時(shí)在天然的野豬儲(chǔ)存宿主中表現(xiàn)為無(wú)癥狀。ASF 導(dǎo)致重要的經(jīng)濟(jì)損失，在缺乏有效疫苗的情況下幾乎無(wú)法避免，目前的疾病控制方式主要是對(duì)感染地區(qū)的隔離檢疫和對(duì)受感染豬只的撲殺。ASF 由ASF 病毒引起，這是一種具有復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA 病毒。ASFV 是Asfarviridae 家族中唯一的成員，也是唯一由節(jié)肢動(dòng)物（Ornithodoros屬的軟蜱）傳播的DNA 病毒。軟蜱（Ornithodoros moubata）參與非洲豬瘟病毒和歐洲O. erraticus 的叢林傳播循環(huán)。與家豬有相似急性癥狀的野豬似乎與ASFV 在歐洲的傳播周期相關(guān)。

這種病毒引起的疾病最早是20世紀(jì)20 年代在肯尼亞發(fā)現(xiàn)。隨后即被局限在非洲，直至20 世紀(jì)中期蔓延到歐洲，后來(lái)擴(kuò)展到南美洲和加勒比地區(qū)。 20 世紀(jì)90 年代，歐洲通過(guò)嚴(yán)格的控制和根除計(jì)劃（撒丁島除外）凈化了這種疾病。然而，在2007 年，ASFV 再次從非洲蔓延到高加索地區(qū)，特別是格魯吉亞，并在2014 年到達(dá)歐盟的東部領(lǐng)土。越來(lái)越多的歐盟國(guó)家，波蘭和3 個(gè)波羅的海國(guó)家開(kāi)始報(bào)告這一疾病的發(fā)生，最近是在摩爾多瓦。由于缺乏具有保護(hù)功效的疫苗，ASF對(duì)所有歐洲國(guó)家都構(gòu)成嚴(yán)重威脅。ASF 在非洲東部和南部的傳播已經(jīng)證實(shí)了其流行復(fù)雜性，ASFV 具有22 種基因型，主要基于編碼主要衣殼蛋白p72 的B646L 基因的C 末端區(qū)域的序列變異特征來(lái)區(qū)分。最近，報(bào)道了一種新的基因型，即基因型XXIII，具有基因型IX 和X 的共同祖先，由東非國(guó)家和剛果共和國(guó)流行的分離株組成。文章總結(jié)了ASFV 的現(xiàn)狀。

2 非洲豬瘟病毒

ASFV 是一個(gè)較大的具有包膜的病毒，具有二十面體形態(tài)，平均直徑為200 nm。病毒基因組由單個(gè)線(xiàn)性、共價(jià)封端的雙鏈DNA 組成。不同分離株的基因組長(zhǎng)度在170 ～190 Kbp 之間變化，編碼151 ～167 個(gè)開(kāi)放閱讀框。ASFV復(fù)制主要是在細(xì)胞質(zhì)，但細(xì)胞核也是早期病毒DNA 合成的部位。鄰近病毒基因組開(kāi)始復(fù)制部位的薄層網(wǎng)絡(luò)發(fā)生分解，以及多種核蛋白重新分布，均表明在病毒感染期間存在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)核的復(fù)雜機(jī)制。

病毒基因的轉(zhuǎn)錄受到有力地調(diào)控。目前，已經(jīng)通過(guò)獨(dú)特的積累動(dòng)力學(xué)，包括早早期，早期、中 期 和 晚 期（immediate-early，early， intermediateand late）轉(zhuǎn) 錄 產(chǎn)物來(lái)確定四類(lèi)mRNA。早早期和早期基因在DNA 復(fù)制開(kāi)始之前表達(dá)，而中期和晚期基因在之后表達(dá)。中期基因的存在說(shuō)明存在級(jí)聯(lián)模式可調(diào)節(jié)ASFV 基因的表達(dá)。病毒從部分未包被的核心顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，使用包裝在病毒顆粒中的酶和其他因子，之后則立即表達(dá)出DNA 復(fù)制所需的酶。病毒在病毒工廠(chǎng)和DNA 復(fù)制的主要晚期完成形態(tài)建立。

3 病毒粒子結(jié)構(gòu)

ASFV 顆粒具有由幾個(gè)同心結(jié)構(gòu)域組成的二十面體形態(tài)：由中心基因組形成的內(nèi)核包含核仁，其被稱(chēng)為核殼的厚蛋白質(zhì)層包覆；然后是圍繞內(nèi)核的內(nèi)部脂質(zhì)包膜；最后是衣殼，這是細(xì)胞內(nèi)病毒粒子的最外層。細(xì)胞外病毒顆粒具有額外的外部包膜，當(dāng)病毒通過(guò)質(zhì)膜出芽時(shí)產(chǎn)生。然而，這種包膜對(duì)病毒感染并非必要，其重要性尚不清楚。

4 病毒進(jìn)入機(jī)制

ASFV 感染周期始于病毒吸附和進(jìn)入宿主細(xì)胞。對(duì)于A(yíng)SFV 進(jìn)入機(jī)制的早期研究將此事件描述為低pH 和溫度依賴(lài)性過(guò)程，與Vero 細(xì)胞和豬巨噬細(xì)胞中可飽和及特異性受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用一致。然而，該病毒的受體仍然未知。ASFV 的有限細(xì)胞嗜性表明感染需要巨噬細(xì)胞特異性受體。ASFV 對(duì)豬巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的感染與CD163 清道夫受體的表達(dá)相關(guān)，這是巨噬細(xì)胞成熟的標(biāo)志之一。之前有報(bào)道提出這是一種可能的病毒受體，因?yàn)獒槍?duì)這一分子的單克隆抗體能夠阻斷原發(fā)性肺泡巨噬細(xì)胞的感染。然而，最近的研究表明CD163 不是感染Georgia 2007/1 病毒分離株所必需的受體。使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)得到的將CD163 基因完全敲除的基因編輯豬顯示，臨床癥狀、死亡率、病理學(xué)或病毒血癥沒(méi)有差異。這些研究的一個(gè)結(jié)論是雖然CD163 可能是必需的，但對(duì)于感染而言還不足夠，其他巨噬細(xì)胞表面蛋白也可能參與感染過(guò)程。

雖然目前有證據(jù)支持受體依賴(lài)的病毒進(jìn)入機(jī)制，例如網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的動(dòng)力蛋白依賴(lài)性?xún)?nèi)吞作用，但是也有證據(jù)表明ASFV 還可利用其他機(jī)制，如吞噬作用和巨噬細(xì)胞增多癥。此外，膽固醇是ASFV 成功進(jìn)入所必需的。當(dāng)使用適合該細(xì)胞系的病毒分離株時(shí)，這些機(jī)制在巨噬細(xì)胞靶細(xì)胞和Vero 細(xì)胞中均可發(fā)生。

此外，一些ASFV 蛋白參與了進(jìn)入機(jī)制，如p30，對(duì)病毒內(nèi)化很重要，而其他蛋白如p12 和p54 經(jīng)鑒定為潛在的病毒附著蛋白。

5 ASFV 進(jìn)入內(nèi)體通路

ASFV 感染最終應(yīng)到達(dá)內(nèi)吞途徑。一旦病毒進(jìn)入內(nèi)吞途徑，其必須通過(guò)不同的內(nèi)吞體群體才能實(shí)現(xiàn)成功感染（圖1）。內(nèi)吞途徑的成熟受到募集到內(nèi)體膜的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)精確調(diào)控。Rab GTPase 蛋白家族是內(nèi)吞成熟途徑的主要調(diào)節(jié)因子，其中Rab 家族的每個(gè)成員特異性定位在不同的內(nèi)體區(qū)室。吸附后的幾分鐘內(nèi)，在用Rab5和EEA1 標(biāo)記物標(biāo)記的早期內(nèi)體（early endosomes，EE）中發(fā)現(xiàn)了入侵病毒。事實(shí)上，完整的衣殼化病毒粒子只能在EE 水平上發(fā)現(xiàn)，而在其他成熟的酸性區(qū)室中卻沒(méi)有。用bafilomycin A1 抑制內(nèi)體酸化可以阻止病毒的脫衣殼作用，但是只有在這種情況下，才有可能在CD63 陽(yáng)性的多泡內(nèi)體和表達(dá)Rab7的晚期內(nèi)體中觀(guān)察到完整病毒。在正常情況下，晚期內(nèi)體內(nèi)僅有缺乏衣殼蛋白的病毒內(nèi)核。

其中涉及發(fā)動(dòng)蛋白和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和巨胞飲作用。僅幾秒鐘即可通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)展并到達(dá)成熟的內(nèi)體區(qū)室，在這里會(huì)發(fā)生病毒脫衣殼和內(nèi)部病毒薄膜與內(nèi)體膜的融合。新合成的病毒體在病毒工廠(chǎng)中組裝，并通過(guò)胞質(zhì)膜上的胞吐作用或通過(guò)形成凋亡小體離開(kāi)細(xì)胞。

在感染后30 ～45 min 之間，在成熟內(nèi)體區(qū)室中的酸性腔內(nèi)發(fā)生病毒脫衣殼。成熟的內(nèi)體區(qū)室是表達(dá)CD63 的多泡體，其特征在于存在管腔內(nèi)囊泡以及表達(dá)Rab7 的晚期內(nèi)體。對(duì)于其他病毒，連續(xù)病毒脫殼和穿透也對(duì)內(nèi)體成熟具有依賴(lài)性。一旦脫殼，病毒顆粒暴露內(nèi)包膜，允許其相互作用，隨后將該病毒膜與內(nèi)體的限制性膜融合，并且裸露內(nèi)核可以釋放到細(xì)胞溶質(zhì)中開(kāi)始復(fù)制。這一過(guò)程強(qiáng)烈依賴(lài)于內(nèi)體膜上的膽固醇流出。事實(shí)上，在這一水平上阻斷膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)導(dǎo)致病毒顆粒滯留在內(nèi)體內(nèi)，從而抑制感染進(jìn)展。內(nèi)包膜病毒蛋白pE248R 也參與病毒融合。該蛋白與痘病毒進(jìn)入/融合復(fù)合物的某些成員具有序列相似性。

其他內(nèi)體成熟抑制劑，如渥曼青霉素（wortmannin），一種阻斷早期內(nèi)體融合的磷脂酰肌醇3（phosphatidylinositol 3，PI3）激 酶抑制劑，以及擾亂微管依賴(lài)性?xún)?nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制劑諾考達(dá)唑也可預(yù)防ASFV 感染。

圖1 ASFV 通過(guò)復(fù)雜過(guò)程進(jìn)入宿主細(xì)胞

6 ASFV 基因表達(dá)和DNA 復(fù)制

進(jìn)入的ASFV粒子應(yīng)當(dāng)?shù)竭_(dá)其在靠近微管組織中心（microtubule organizing center，MTOC）的核周區(qū)域的復(fù)制位點(diǎn)。早早期和早期基因在DNA 復(fù)制開(kāi)始之前表達(dá)。兩條DNA 鏈都是用作編碼鏈的替代品，這可能是通過(guò)包裝在病毒核心中的參與病毒轉(zhuǎn)錄的多種酶的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。DNA 復(fù)制后，開(kāi)始進(jìn)行中期和晚期基因的轉(zhuǎn)錄。ASFV 基因組約占其mRNA 轉(zhuǎn)錄和修飾所涉及的基因的20%。這種轉(zhuǎn)錄機(jī)制使ASFV 與宿主相對(duì)獨(dú)立，并對(duì)其基因表達(dá)進(jìn)行精確的時(shí)空調(diào)控。雖然核在病毒復(fù)制中的確切作用仍不清楚，但已經(jīng)通過(guò)原位雜交和放射自顯影在感染細(xì)胞的切片中確定了ASFV 的DNA 復(fù)制中核階段的存在。在堿性蔗糖梯度中進(jìn)行復(fù)制病毒DNA 的沉淀分析，結(jié)果顯示在病毒DNA 復(fù)制的早期，小DNA 片段在細(xì)胞核中被脈沖標(biāo)記，而較大的分子在細(xì)胞質(zhì)中于后續(xù)時(shí)間內(nèi)合成。在A(yíng)SFV 感染的細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中合成的復(fù)制中間體由頭對(duì)頭的多聯(lián)體組成。細(xì)胞核可能提供引發(fā)病毒復(fù)制所需的小轉(zhuǎn)錄子或其他因子，或者應(yīng)該發(fā)生病毒DNA 復(fù)制的早期階段。

7ASFV 和凋亡

ASFV 感染后的ER 應(yīng)激反表現(xiàn)為caspase 12 的激活，其與線(xiàn)粒體caspase 9 和效應(yīng)caspase 3 的激活具有相似的時(shí)間動(dòng)力學(xué)。細(xì)胞凋亡是一種重要的預(yù)防病毒感染的先天細(xì)胞機(jī)制，多種病毒已經(jīng)進(jìn)化出對(duì)這種細(xì)胞反應(yīng)的抑制或延遲策略。因此，ASFV A179L 基因編碼抗凋亡的Bcl-2 蛋白的同源物，以延長(zhǎng)宿主細(xì)胞存活，直到病毒基因組的復(fù)制完成。這種病毒Bcl-2 在感染后的早期和晚期都有表達(dá)，并抑制多種促凋亡的BH3-only 蛋白的作用，已知其為細(xì)胞凋亡的快速誘導(dǎo)因子，例如激活的Bid，BimL，BimS，BimEL，Bad，Bmf，Bik，Puma 和DP5。另 一 種ASFV 基因——A224L，編碼已知為IAP 蛋白的凋亡抑制劑家族成員，能夠抑制半胱天冬酶活化并促進(jìn)細(xì)胞存活。病毒性IAP 不僅可以阻斷caspase-3 活化，還可以激活NF-κB。有趣的是，該病毒編碼一種干擾NF-κB 活化的IκB 樣分子（A238L）。A238L 和A224L 在A(yíng)SFV 感染期間的不同時(shí)間表達(dá)，這表明ASFV 在感染早期需要相對(duì)低的NF-κB 活性以避免免疫應(yīng)答，但是在后期需要較高活性，可能在細(xì)胞系統(tǒng)被濫用時(shí)阻止細(xì)胞的凋亡。在A(yíng)SFV 感染的最晚階段，受感染的細(xì)胞經(jīng)歷凋亡，并且顯示程序性細(xì)胞死亡的特征形態(tài)變化，包括受感染細(xì)胞發(fā)生典型的膜起泡，形成許多含病毒的囊泡，這可能一個(gè)有效的病毒傳播體系。

8 ASFV 和自噬

A179L 是非洲豬瘟病毒的病毒Bcl2 同源物，不僅與促凋亡的Bcl2 家族蛋白相互作用以抑制細(xì)胞凋亡，而且通過(guò)其與BH3 同源結(jié)構(gòu)域的Beclin1 相互作用抑制自噬。與其他DNA 病毒一樣，ASFV 有抵消自噬清除作用的防御體系。其中一個(gè)例子是HSV-1 ICP34.5 蛋白，可通過(guò)與Beclin1的作用來(lái)抑制自噬。ASFV 編碼與ICP34.5 同源的蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮其他功能。ASFV DP71L 抑制激活PP1/蛋白磷酸酶1 的ER 應(yīng)激反應(yīng)。然而，與HSV-1 ICP34.5相反，其不會(huì)與Beclin1 發(fā)生相互作用。

事實(shí)上，ASFV 感染不會(huì)在Vero 細(xì)胞中誘導(dǎo)LC3 活化或自噬體形成。自噬是相關(guān)的細(xì)胞防御機(jī)制，其允許細(xì)胞組分的有序降解和再循環(huán)。自噬消除細(xì)胞內(nèi)病原體，并且對(duì)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答具有至關(guān)重要的作用。一些DNA 病毒，例如ASFV 和HSV-1，已經(jīng)進(jìn)化出控制這種細(xì)胞反應(yīng)的策略，以防止新組裝的病毒顆粒的降解。相反，據(jù)報(bào)道大多數(shù)RNA 病毒在感染細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬，并且在一些情況下自噬可以促進(jìn)病毒復(fù)制。

9 ASFV 逸出細(xì)胞

成熟的病毒顆粒通過(guò)微管介導(dǎo)的機(jī)制從病毒工廠(chǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，取決于運(yùn)動(dòng)蛋白常規(guī)驅(qū)動(dòng)蛋白和衣殼蛋白pE120R。一旦進(jìn)入細(xì)胞表面，粒子就會(huì)通過(guò)在膜上出芽而離開(kāi)宿主細(xì)胞，從而獲得額外的包膜。 細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外病毒都具有感染性，但結(jié)構(gòu)和抗原性不同，這可能對(duì)宿主對(duì)ASFV 的免疫反應(yīng)具有重要意義。

10 潛在的疫苗和抗病毒藥物

之前針對(duì)ASFV 疫苗的開(kāi)發(fā)嘗試均未能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。目前，有幾項(xiàng)基于減毒活A(yù)SFV（live attenuated ASFV，LAV） 的實(shí)驗(yàn)疫苗可引發(fā)保護(hù)作用，其中包括在基因組中敲除單個(gè)或多個(gè)基因等方法，包括DNA 疫苗。其中一些有希望能轉(zhuǎn)化為成功的候選疫苗。如今，可用的疫苗應(yīng)當(dāng)滿(mǎn)足多種要求。任何候選的ASFV 疫苗都應(yīng)包括可用于區(qū)分受感染或接種疫苗動(dòng)物的標(biāo)記，以便進(jìn)行診斷。而且，由于缺少可支持減毒疫苗病毒復(fù)制而不改變病毒毒力的細(xì)胞系，疫苗生產(chǎn)尚無(wú)法進(jìn)行。目前，野豬被發(fā)現(xiàn)是波羅的海和波蘭非洲豬瘟傳播的主要參與者。因此，針對(duì)這些動(dòng)物的誘餌活疫苗對(duì)于限制疾病傳播至關(guān)重要。在目前的情況下，疫苗可以與感染檢測(cè)一同進(jìn)行，以實(shí)現(xiàn)對(duì)該疾病的凈化。現(xiàn)有的診斷方法可以實(shí)現(xiàn)病毒檢測(cè)，同時(shí)也可檢測(cè)抗體，以鑒別幸存者和無(wú)癥狀攜帶者。

在有效疫苗開(kāi)發(fā)出來(lái)之前，依然存在使用抗病毒藥物的可能性?？共《静呗砸褟V泛應(yīng)用于人類(lèi)感染，也可用于動(dòng)物健康領(lǐng)域?？共《舅幬镆部捎糜谠诒┌l(fā)后對(duì)病毒傳播進(jìn)行早期控制。此外，抗病毒藥物與疫苗接種方案的組合可用于引發(fā)免疫應(yīng)答，從而有效預(yù)防疾病。在這里，我們已經(jīng)對(duì)潛在的分子靶點(diǎn)進(jìn)行了綜述，其均可作為抗病毒的目標(biāo)位點(diǎn)。針對(duì)ASFV 的抗病毒藥物包括白藜蘆醇和氧化白藜蘆醇，微藻，膽固醇降低類(lèi)藥物或膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，抗腫瘤月桂基—沒(méi)食子酸酯，抗驚厥丙戊酸，發(fā)動(dòng)蛋白抑制劑，氟喹諾酮類(lèi)，絲氨酸蛋白酶抑制劑，特異性多肽等。 這些藥物可以最終應(yīng)用于快速反應(yīng)，以減少易感動(dòng)物，以便在暴發(fā)周?chē)鷦?chuàng)建“安全區(qū)域”，從而控制感染的傳播。