黑色素瘤癌組織中AQP1和AQP3表達水平與臨床病理特征及預后不良的相關性

謝 群 胡 強 劉丹丹 山 超 楊 靖 張瑞瑞

黑色素瘤是1種具有高度侵襲性和轉移性的惡性腫瘤[1]。

水通道蛋白家族(aquaporins，AQPs)是水和小溶質運輸的被動通道。近年研究顯示，AQPs與不同類型疾病的發生有關，且AQPs在血管生成、細胞遷移和腫瘤生長中起重要作用[2-3]。研究證據表明，AQP1和AQP3參與皮膚角質形成細胞和內皮細胞等的遷移[4]。此外，AQP1和AQP3在不同類型的腫瘤中具有比在相應的正常組織中相對更高的表達水平[5]。本研究通過對80例接受手術治療的黑色素瘤患者癌組織中AQP1和AQP3蛋白水平進行檢測，旨在探討兩者與黑色素瘤的潛在關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年8月于湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院整形美容科經病理學初次確診的黑色素瘤患者80例，診斷標準依據美國抗癌聯合會黑色素瘤指南第八版[6]。所有患者均經我科手術治療，黑色素瘤和癌旁組織均置于-80 ℃冰箱儲存。患者中位年齡為47歲，年齡32～64歲，平均年齡為(48.3±8.6)歲；男性55例，女性25例；Ⅰ期42例，Ⅱa期20例，Ⅱb期13例，Ⅲ期5例；高分化41例，中分化29例，低分化10例。納入標準：①手術治療前未接受其他治療；②知曉本研究目的，并同意參與者；③最終配合研究人員完成隨訪者。排除標準：①已接受放化療治療者；②知曉研究目的后明確拒絕參與本研究者；③隨訪過程中的失訪者。本項目經醫院倫理會批準。

1.2 術后隨訪

術后對80例黑色素瘤患者進行30個月電話隨訪，隨訪日期截止至2019年2月，記錄患者的生存時間。隨訪終點為：①30個月內死亡；②30個月隨訪結束。

1.3 免疫組織化學法檢測及蛋白定量

所有組織樣品均用4%甲醛固定，而后對樣品進行脫水，石蠟包埋，切片。將切片室溫封閉1 h(5%血清)，加入單克隆抗體AQP1和AQP3，堿性磷酸酶二抗4 ℃孵育(抗體購于Abcam公司)。分別加入鏈霉親和素-過氧化物酶和二氨基聯苯胺恒溫顯色封片。應用ImagePro Plus對免疫組化結果進行分析，并按陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱評分(x×y)，x代表陽性細胞百分比：x=0，無陽性細胞；x=1，陽性細胞為1%～10%；x=2，陽性細胞為11%～50%；x=3，陽性細胞為51%～80%，x=4陽性細胞所占比例達81%以上。y代表陽性細胞染色強弱：y=0，陰性；y=1，弱陽性；y=2，中度陽性；y=3，強陽性。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 黑色素瘤AQP1和AQP3免疫組織化學結果

與癌旁組織相比，黑色素瘤組織中AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分均顯著增高(P<0.05)，見表1。

表1 AQP1和AQP3蛋白的免疫組化評分

2.2 AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分與黑色素瘤預后

共11例患者在30個月隨訪期間死亡。與低AQP1組相比，高AQP1組患者生存率顯著降低(χ2=5.241，P=0.022，圖1-A)；與低AQP3組相比，高AQP3組患者生存率顯著降低(χ2=8.384，P=0.004，圖1-B)。

圖1 AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分與黑色素瘤預后的分析

2.3 黑色素瘤組織AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分與臨床病理特征的相關性

依據AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分中位數(AQP1：9分；AQP3：6分)，將80例患者分為高、低組。黑色素瘤組織中AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分在患者不同年齡和性別間均無顯著差異(P>0.05)，而分期越晚和分化程度越低患者的AQP1和AQP3免疫組化評分越高，見表2。且AQP1和AQP3水平與分期(AQP1：γ=0.543，P=0.001；AQP3：γ=0.562，P=0.002)和分化程度(AQP1：γ=0.516，P=0.002；AQP3：γ=0.497，P=0.007)呈顯著線性關聯，見表3。

表2 AQP1和AQP3免疫組化評分與黑色素瘤臨床病理特征的關系/例

表3 AQP1和AQP3免疫組化評分與黑色素瘤臨床病理特征的相關性分析

3 討論

黑色素瘤最主要的特征是瘤體不受限制的生長及早期轉移，具有高度侵襲性，但其相關機制尚不清楚。數據顯示，其發病率在過去二十年間呈持續增高趨勢。雖然大多數黑素瘤病例可接受手術切除原發腫瘤病灶，但該病的轉移形式多樣且患者預后不良[7]。此外，腫瘤細胞對治療又具有高度抵抗性，最近報道指出，免疫抑制療法在約60%的晚期黑色素瘤患者治療中顯示對疾病進程控制效果較差[8]，因此迫切需要找尋基于新靶標的更為有效的治療策略。

近年研究發現，在皮膚組織真皮層中存在AQP蛋白家族。值得關注的是，在AQP蛋白家族中，AQP1和AQP3已在多個腫瘤中被證實參與腫瘤細胞的遷移與增殖[2-3,5]。Saadoun等[9]經皮下注射黑色素瘤細胞后，缺乏AQP1的小鼠由于腫瘤內新生血管形成受損而表現出腫瘤生長減弱，當從AQP+/+和AQP-/-小鼠中提取并培養主動脈內皮細胞時，與AQP+/+內皮細胞相比，AQP-/-內皮細胞對趨化性刺激的遷移活性較低。Korany等[10]發現，AQP3通過水和甘油轉運調節角質形成細胞的遷移和增殖，并最終促進皮膚傷口愈合；此外，他們還發現由于皮膚表皮水合作用受損，缺乏AQP3的小鼠傷口愈合被延遲。上述研究均提示，皮膚中AQP1和AQP3表達在黑色素瘤生物學進展，特別是在腫瘤轉移與侵襲等中有重要作用，進而影響患者預后。本研究通過運用免疫組織化學技術對80例經手術治療的黑色素瘤組織標本內AQP1和AQP3水平進行檢測，并對兩者水平與患者預后間的關系進行分析。

本次研究我們發現，與癌旁組織相比，黑色素瘤組織中AQP1和AQP3蛋白免疫組化評分均顯著增高；且分期越晚和分化程度越低的患者，其AQP1和AQP3免疫組化評分越高；相關性分析進一步提示，AQP1和AQP3水平與黑色素瘤高分期和低分化程度呈顯著線性關聯。上述研究提示，黑色素瘤患者癌組織中AQP1和AQP3的增高與患者腫瘤發展程度加深有緊密關系，且我們的研究結果與前期Saadoun等[9]和Korany等[10]的結果一致，AQP1和AQP3參與黑色素瘤細胞的惡性進展。上述發現在30個月的隨訪完成后得到了進一步的證實，組織中高AQP1與高AQP3患者的生存率均顯著低于低AQP1與低AQP3者。我們的研究結果提示，對黑色素瘤患者組織中AQP1和AQP3蛋白定量對預后評估具有一定意義。然而，本研究有如下不足：①本研究尚缺乏一定的基礎研究，對干擾黑色素瘤細胞系中AQP1和AQP3基因表達是否對細胞的生物學功能產生影響有待進一步分析；②關于外周血清中AQP1和AQP3蛋白的定量檢測對黑色素瘤診斷和預后評估價值仍有待進一步探討；③后期仍需加大樣本量并擴大患者來源(我國的不同地區)以明確我們的研究結果。

綜上所述，我們發現黑色素瘤癌組織中AQP1和AQP3表達增高與患者預后不良密切關聯。