miR-222對肺癌細胞的生物學特性影響

周 敏 郭建峰

當前肺癌位于惡性腫瘤全球發病率和死亡率第一位，不過生長分裂較慢，擴散轉移比較晚，患者早期沒有特征性臨床癥狀[1-2]。手術為肺癌的主要根治方法，但是很多患者在確診時失去了手術治療指征。現代研究顯示肺癌的發生、發展和侵襲轉移是1個涉及多因素、多過程、多步驟的復雜漫長過程，抑癌基因的缺失或表達失調是肺癌發生與發展的主要原因之一[3-4]。MicroRNAs(miRNAs)是1類進化高度保守、內源性的小分子編碼RNA，可參與調控細胞增殖、分化、凋亡、遷移等多種生物學事件[5-6]。miRNAs與肺癌的發生與發展有顯著相關性，當前研究顯示miR-222異常表達與肺癌的惡性轉化、臨床預后、細胞信號轉導、增殖、浸潤轉移等有一定關系，其作用機制尚未完全清楚[7-8]。雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)是1種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，人mTOR基因編碼由2549個氨基酸組成的蛋白質，在細胞的增殖與凋亡過程中起著中心調控點的作用，也是腫瘤發生、發展的重要原因之一[9-11]。本文具體探討了miR-222對肺癌細胞的生物學特性影響及其機制。現總結報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

研究時間為2017年2月到2018年1月，人肺癌A549細胞系購買于中國科學院上海細胞庫，保存在本實驗室；miR-222 mimics、miR NC、miR-222 inhibitor購自上海吉瑪公司；羊抗鼠PTEN、Akt、mTOR抗體與GAPDH內參抗體購自Santa Cruz 公司；QuickShuttle轉染試劑購自Sigma公司；Annexin V FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自上海生工公司。DMEM細胞培養液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；HRP抗兔二抗購自英國Abcam公司。

1.2 細胞轉染

取對數生長期A549細胞胰酶消化后，以1×106細胞密度接種于6孔培養板中，培養過夜后進行轉染。適量miR-222 mimics(實驗組)、miR NC(對照組)、miR-222 inhibitor(抑制組)轉移至離心管中，使得終濃度為50 nM。將miRNAs與轉染試劑混合液加入培養細胞中，轉染完成后采用DMEM培養基繼續培養。轉染后48 h提取各組細胞的總RNA，采用qRT-PCR方法檢測miR-222表達情況。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

轉染后24 h、48 h，各組細胞孔中加入20 μl 0.5 mg/ml MTT溶液繼續培養，6 h后終止培養，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min后使用酶標儀540 nm波長處檢測細胞光密度，檢測與計算增殖活性。

1.4 雙染法檢測細胞凋亡

轉染后24 h、48 h，各組細胞采用無菌PBS洗滌2遍，用250 μl結合緩沖液懸浮細胞，調整細胞濃度為5×105/ml左右，取200 μl的細胞懸液加入10 μl的Annexin-FITC，再加入10 μl濃度20 μg/ml的PI錠，室溫避光孵育10 min，加入500 μl PBS進行重懸，在上流式細胞儀讀數與記錄細胞凋亡指數。

1.5 Western-blot檢測細胞蛋白表達

轉染后48 h后在各組細胞中加入400 μl的RIPA裂解液，用槍頭反復吹打均勻，室溫放置10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清測定蛋白濃度后。取20 μg蛋白跑SDS-PAGE膠，采用Western-blot檢測細胞蛋白表達情況，一抗(1∶1 000)、4 ℃孵育過夜，二抗(1∶5 000)37 ℃放置30 min，采用Odyssey熒光檢測儀檢測目的條帶，使用GAPDH作為內參。

上述實驗都重復3次，取平均值。

1.6 統計學方法

應用SPSS 23.00軟件進行分析，結果中的計量數據按照均數±標準差(Mean±SD)來表示，兩組與多組間比較采用t檢驗、單因素方差分析(one-wayANOVA)，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 miR-222表達對比

轉染48 h后，實驗組中miR-222表達水平顯著上調，抑制組顯著降低，與對照組對比差異都有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 三組轉染后48 h的miR-222相對表達量對比

注：與對照組對比，*為P<0.05；與抑制組對比，#為P<0.05。

2.2 細胞增殖活性對比

轉染24 h、48 h后，實驗組的細胞增殖活性顯著高于抑制組與對照組(P<0.05)，抑制組與對照組對比差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組轉染后不同時間點的細胞增殖活性對比

注：與對照組對比，*為P<0.05；與抑制組對比，#為P<0.05。

2.3 細胞凋亡率對比

轉染24 h、48 h后，實驗組的細胞凋亡率顯著低于抑制組與對照組(P<0.05)，抑制組與對照組對比差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 三組轉染后不同時間點的細胞凋亡率對比

注：與對照組對比，*為P<0.05；與抑制組對比，#為P<0.05。

2.4 PI3K/AKT/mTOR蛋白表達對比

轉染48 h后，實驗組的m-TOR蛋白表達水平顯著高于抑制組與對照組(P<0.05)，三組PI3K、AKT蛋白表達水平對比差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 三組轉染后48h的PI3K/AKT/mTOR蛋白表達對比

注：與對照組對比，*為P<0.05；與抑制組對比，#為P<0.05。

3 討論

當前肺癌對人們健康的威脅日益嚴重，雖然當前治療方法與藥物不斷推陳出新，但患者的5年生存率并沒有顯著提高[12]。因此尋找影響肺癌發生與發展的分子標志物，對早期診治肺癌具有重要的價值。miRNAs是1類長約22nts的單鏈RNA，屬內源性非編碼小RNA，人體基因組中超過1/3的蛋白編碼基因可能受miRNAs調控，各種因素所導致的miRNAs表達異常，都可造成機體產生疾病[13-14]。

miR-375 mimic的導入能夠模擬細胞內的內源性miR-222，建立miRNA過表達的模型；而miRNA inhibitor是可以與miR-222完全互補的反義寡核苷酸序列，轉染后可抑制miRNA的功能[15]。本研究轉染后檢測顯示發現mimic組miR-22的表達水平顯著高于對照組，抑制組miR-222的表達水平顯著低于對照組，表明本研究成功地建立了miR-22過表達及體系抑制表達的瞬時表達。當前研究表明miR-222可參與多種腫瘤的形成和發展，在頭頸部、胰腺癌、肝癌、胃癌腫瘤中呈高表達狀況[16-17]。本研究顯示轉染48 h后，實驗組中miR-222表達水平顯著上調，抑制組顯著降低，與對照組對比差異都有統計學意義(P<0.05)。轉染24 h、48 h后，實驗組的細胞增殖活性顯著高于抑制組與對照組(P<0.05)，抑制組與對照組對比差異無統計學意義(P>0.05)，表明miR-222的過表達能促進肺癌細胞的增殖。最近研究顯示miR-222的過表達使肺癌細胞A549侵襲轉移能力增強，促使基底膜降解增多，破損處增多，利于腫瘤細胞從原發灶脫離、遷移，促進細胞增殖[18-19]。

miRNAs介導的轉錄后調控是1種重要的表觀遺傳學手段，于人體內miRNAs已超過千種，調控了人體內60%的功能基因的表達，并在細胞增殖、凋亡等多個生理過程中發揮著重要作用，其可通過間接或直接的方式參與疾病的病理進程[20]。細胞凋亡情況是反應細胞損傷程度的重要指標，本研究顯示轉染24 h、48 h后，實驗組的細胞凋亡率顯著低于抑制組與對照組(P<0.05)，抑制組與對照組對比差異無統計學意義(P>0.05)。當前也有研究顯示miR-222具有抑制細胞凋亡的作用，它可通過激活AKT通路促進活性氧的釋放，最終抑制凋亡的發生[21-22]。

某一特定miRNA可同時作用多個靶基因，而同1個基因又可受到多個miRNA轉錄后調控[23]。有研究顯示PI3K是miR-222的靶基因，它可通過下調PIK3受體表達抑制下游信號而發揮調節作用[24]。本研究顯示轉染48 h后，實驗組的m-TOR蛋白表達水平顯著高于抑制組與對照組(P<0.05)，三組PI3K、AKT蛋白表達水平對比差異無統計學意義(P>0.05)。由此推測miR-222可通過間接影響P13K/AKT/mTOR信號傳導實現對肺癌的調控作用。當前也有研究表明miR-222的高表達可使PI3K激酶活性相對增強，激活PI3K/AKT/mTOR信號途徑，利于腫瘤細胞的增殖[25]。

綜上所述，miR-222基因過表達可通過激活Akt-mTOR信號通路，降低肺癌細胞凋亡指數，提高細胞增殖活性，從而發揮促癌作用。