PD1蛋白表達在浸潤性乳腺癌中的臨床意義

楊麗萍 羅慶豐 高 玟 孫正魁 李江龍 梁璟慧 王烈亮

乳腺癌是我國女性發病率最高的惡性腫瘤，本研究應用免疫組化法檢測改良根治術后乳腺癌患者的PD1蛋白表達情況，探討PD1/PDL1信號表達情況與乳腺癌臨床病理特征和相關分子表型的關系，為乳腺癌患者的合理治療選擇做出有益的探索。

1 材料與方法

1.1 一般資料

江西省腫瘤醫院2013年5月至2016年5月收治117例乳腺癌患者，經病理檢查確診為浸潤性導管癌，均為女性，年齡32～68歲，平均年齡(50.8±2.6)歲。

1.2 主要試劑

PD1購自北京中杉金橋生物技術有限公司，克隆號MRQ-22,為工作液，參考滴度為1∶200。

1.3 標本采集與處理

117例乳腺癌標本經過病理檢查證實為浸潤性導管癌，檢測腫瘤PD1表達采用MaxvisionTM免疫組化法，按照PD1試劑盒的操作說明進行，具體步驟：①4 μm連續切片，裱于涂有APES的載玻片上，70 ℃烤片2 h;②二甲苯脫蠟2次，5個梯度酒精脫水；③3%H2O2室溫孵育30 min；④pH 6.0檸檬酸溶液中，微波熱修復抗原5 min，保溫10 min，自然冷卻；⑤PBS洗,3 min×2次；⑥滴加PD1抗體100 μl，置4 ℃冰箱12 h；⑦室溫復溫1 h，PBS沖洗3 min×2次；⑧滴加Maxvision二抗抗體，室溫孵育1 h；⑨PBS沖洗3 min×2次；⑩DAB光鏡下顯色，出現棕色顆粒，停止顯色，蘇木精復染，封片。

1.4 判定標準

PD1在細胞質呈棕黃色顆粒沉著者為陽性。PD1染色結果根據陽性細胞 所占百分率進行半定量分析[1]，PD1根據顯色癌細胞的比例記分：<1%為陰性，>1%者為陽性。陽性對照為北京中杉金橋生物技術有限公司的肺癌組織PD1蛋白陽性組織片，陰性對照：PBS代替一抗。

1.5 統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件進行四格表卡方檢驗和R×C行列表檢驗分析。

2 結果

117例浸潤性導管癌患者PD1陽性表達率為23.1%。PD1陽性表達率與乳腺癌脈管浸潤和腋窩淋巴結轉移情況呈顯著性相關(P<0.05)，與患者年齡、組織學分級、腫瘤大小、腫瘤分子表型的ER、PR、CerBb-2的陽性結果及淋巴細胞浸潤情況無顯著性相關(P>0.05)，見表1。

表1 117例乳腺癌PD1表達與臨床病理特征的關系

3 討論

乳腺癌是女性高發腫瘤，根據2017年癌癥統計中心數據，其排在女性腫瘤發病率的首位。三陰性乳腺癌的治療效果較差，免疫治療是近期乳腺癌規范治療中的研究熱點[2]。國內外研究進展表明PD1/PDL1信號在腫瘤免疫治療中的作用在抗腫瘤免疫中，通常遵循腫瘤特異性T細胞活化、T細胞增殖、腫瘤浸潤和T細胞記憶應答加強的步驟。研究表明，腫瘤細胞以及腫瘤微環境中的APCs表達的PDL-1均可經PD-1/PDL-1信號通路抑制腫瘤抗原特異性T細胞的活化，下調T細胞介導的腫瘤免疫應答[3]。本研究檢測乳腺癌細胞的PD-1表達與其臨床病理特征和其他相關分子表型的關系，為乳腺癌患者選擇免疫治療指標提供理論依據。

PD-1(programmed death-1)最初是在凋亡的T細胞雜交瘤中得到的，由于其和細胞凋亡相關而被命名為程序性死亡-1基因，通過其配體形成PDL-1/PD-1通路發揮其生物學效應。PDL-1(B7-H1)屬于B7家族，具有IgV和IgC樣區、跨膜區及胞漿區尾部，PDL-1與其T細胞上的受體PD1相互作用，在免疫應答的負性調控方面發揮著重要作用；該分子具有廣泛的組織表達譜，在一些腫瘤細胞系上有較高的表達，許多研究均表明其與腫瘤的免疫逃逸機制相關[4]。腫瘤部位的微環境可誘導腫瘤細胞上的PDL-1的表達，且表達廣泛，表達的PDL-1有利于腫瘤的發生和生長，誘導抗腫瘤T細胞的凋亡[5]。轉染PDL-1基因的P815腫瘤細胞系在體外可抵制特異性CTL的裂解，將其接種小鼠體內后具有更強的致瘤性和侵襲性。這些生物學特性均可通過阻斷PDL-1而逆轉。敲除PD1基因的小鼠，阻斷PDL-1/PD-1通路，則接種腫瘤細胞不能形成腫瘤。在許多人類腫瘤組織中均可檢測到PDL-1蛋白的表達，且許多癌組織較正常組織中的PDL-1表達水平明顯上調。在乳腺癌、胃癌、腸癌[5]、食管癌、卵巢癌、宮頸癌等人類腫瘤組織中檢測到PDL-1蛋白的表達，且PDL-1的表達水平和患者的臨床及預后緊密相關[6]。本研究中發現PDL-1蛋白的表達與乳腺癌的脈管浸潤和淋巴結浸潤密切相關，提示腫瘤組織表達PDL-1蛋白能夠促使癌細胞的免疫逃逸，促進腫瘤的轉移。本研究顯示PD1表達與CerBb-2、ER與PR表達無關，在不同的乳腺癌亞型中無明顯差異，但是與乳腺癌的浸潤和轉移能力密切相關，這與Muenst的研究結果一致，PD1是預后不良的因素。

國內外研究進展表明PD1/PDL1信號在腫瘤免疫治療中的作用在抗腫瘤免疫中，通常遵循腫瘤特異性T細胞活化、T細胞增殖和T細胞記憶應答加強的步驟。研究表明，腫瘤細胞以及腫瘤微環境中的APCs表達的PDL-1均可經PD-1/PDL-1信號通路抑制腫瘤抗原特異性T細胞的活化，下調T細胞介導的腫瘤免疫應答。PDL-1單抗能有效抑制局部腫瘤生長；阻斷PD-1/PDL-1信號可以促進腫瘤抗原特異性T細胞的增殖，發揮殺傷腫瘤細胞的作用；阻斷腫瘤細胞上相關PDL-1信號可上調浸潤CD8+T細胞IFN-γ的分泌，表明PD-1/PDL-1信號通路的阻斷在以誘導免疫應答為目的的腫瘤免疫應答中發揮作用，特別是在基底細胞樣乳腺癌[7]；與本研究發現有淋巴細胞浸潤的乳腺癌PD1表達降低相一致，為乳腺癌的設計個體化綜合治療提供依據。