凍存復蘇及4℃存放對成纖維細胞的影響

李瑩　王英　羅浩虹　吳娟英

【摘 要】目的：探索凍存復蘇及4℃存放對細胞活性的影響。方法：培養細胞，凍存復蘇后，利用臺盼藍染色和MTT法檢測細胞的活性。結果：臺盼藍染色顯示，未凍存的活力平均為96.57±1.21（%），而凍存細胞的細胞活力平均為74.29±2.14（%），兩組有顯著性差異（P<0.01）。4℃保存的細胞存放超過3h以上（第4h開始），細胞的存活顯著降低。兩組細胞之間的吸光度也出現同樣趨勢。

結論：細胞在4℃保存，3h內可保持活力不變。

【關鍵詞】成纖維;臺盼藍;MTT

中圖分類號： R114 文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2019）29-0210-001

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.29.099

隨著生物及細胞類制劑的增多，細胞在越來越多方面應用，而細胞的存放往往限制了細胞的應用。成纖維細胞是臨床常用的一種細胞，可以促進細胞表皮遷移、增殖和分化[1]，培養方法相對成熟，性狀穩定，存活能力強，是細胞制劑中的種子細胞。本實驗以小鼠成纖維細胞為研究對象，初步確定了復蘇后以及4℃保存狀態下的細胞狀態，為細胞的臨床使用提供了依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

主要試劑：IMDM培養基，PBS（pH=7.4），胎牛血清，L-谷氨酰胺，青鏈霉素抗生素，0.25%胰蛋白酶（invitrogen，美國），多聚賴氨酸（sigma，美國），0.5%MTT溶液、20%SDS，臺盼藍試劑（sigma，美國）。

主要儀器：CO2培養箱（Thermo，德國）、低速離心機、6孔培養板、96孔培養板（Corning，美國），倒置顯微鏡（Olympus，日本）、酶標分析儀、超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 成纖維細胞的制備

取無菌條件下的小鼠皮膚組織2塊，分離真皮，剪成小塊，加0.25%胰蛋白酶反復吹打消化，用含血清的DMEM/F12培養基清洗，離心1200r/min，8min，棄上清，按1×105/ml細胞濃度加10%牛血清DMEM/F12培養液培養。待細胞貼壁，據細胞生長情況傳代和換液。

1.2.2 細胞的凍存

收集培養好的細胞，加入細胞凍存液（5%DMSO+45%胎牛血清），采用梯度降溫法凍存：現象細胞置于4℃冰箱內放置1h，-20℃冰箱內放置2h，-80℃超低溫冷凍過夜，最后置于液氮中保存。

1.2.3 凍存后復蘇

取凍存3個月的細胞，37℃水浴，快速解凍，離心洗滌后備用。

1.2.4 臺盼藍染色

將新鮮培養的成纖維細胞與復蘇后的細胞懸液分別與3μL 0.4%的臺盼藍染液混合，取少許混合液置于血細胞計數板的計數池，于普通顯微鏡下記錄計數板4個大方格內的總細胞數和死細胞數。另取一組細胞，按時間（時間間隔為1h）依次取出細胞懸液加培養液至1ml，混勻，取其中的90μL細胞懸液與10μL 0.4%的臺盼藍染液混合，取少許混合液充至血細胞計數板的計數池，1min內讀數，于普通顯微鏡下記錄計數板內四個大方格內的總細胞數和死細胞數，胞核藍染者為死細胞。分別計算細胞存活率。

1.2.5 MTT染色

分別將上述細胞的細胞懸液混合均勻，培養于96孔培養板，每孔100ml，置于37℃，5%的CO2恒溫培養箱孵育，3-4d后按順序加入10μL 0.5%的MTT溶液，繼續孵育培養6-8h后，細胞內會產生藍色結晶;加入10μL 20%的SDS，繼續孵育過夜，使結晶溶解，取出用酶標儀570nm比色，讀取各組吸光度值，算取平均值為橫坐標，時間為縱坐標繪制折線圖。

1.3 統計學處理

各組計量資料統計學處理采用SAS軟件（9.0版本）行t檢驗。

2 結果

2.1 臺盼藍染色

細胞經臺盼藍染色后，普通顯微鏡下可見活細胞的胞質和胞核透亮，死細胞核藍染。未凍存的細胞活力平均為96.57±1.21（%），而凍存細胞的細胞活力平均為74.29±2.14（%），兩組有顯著性差異（P<0.01）。將4℃存放的細胞分別進行細胞計數可見，4℃保存3h以內，細胞的存活率無顯著性差異（P>0.05），而存放超過3h以上（第4h開始），細胞的存活率有顯著性差異（P<0.05）。

2.2 MTT染色

活細胞中的琥珀酸脫氧酶可使MTT分解產生藍色結晶狀甲瓚顆粒，聚集于細胞內或其周圍，其吸光度值與細胞數呈正比，間接反應細胞的增殖活性。實驗結果顯示，4℃保存的細胞，在3h以內的各組細胞吸光值之間無顯著性差異（P>0.05），4h后各組的細胞吸光值之間有顯著性差異，并有明顯的下降趨勢。

3 討論

細胞屬于生物制品，因此在臨床應用中的使用不像藥品，需要注意存放的溫度，存放時間等。在本文的實驗研究中，我們著重解決了兩個問題，一是凍存細胞復蘇后的細胞存活率問題，二是用于臨床的細胞在4℃存放的最長有效時間問題。細胞的凍存及復蘇是細胞實驗中遇到的常規問題。由于組織的取材受時間地點等因素的限制，加之細胞的培養需要一定的時間，培養好的細胞不一定馬上應用于臨床，因此常將細胞低溫凍存。成纖維細胞的凍存方法較多，目的是盡量減少凍存后對細胞的損傷。保護劑的選擇、溫度的控制及冷凍程序等的不同都會影響細胞復蘇后的存活率、活性及克隆形成。現已證實，液氮凍存比-80℃冰箱的凍存效果好[2]。在本次實驗中，我們采用5%DMSO+45%胎牛血清的凍存液，確保最佳凍存效果[3]。實驗結果顯示，凍存復蘇后細胞的細胞存活率及細胞活力較未凍存細胞均有顯著性差異，說明液氮凍存對細胞的確存在損傷，但復蘇后的細胞存活率仍可達到70%左右，而4℃保存3h以內，細胞活力不變。

【參考文獻】

[1]陳渴，張會波.原代人尿道狹窄成纖維細胞的體外培養及鑒定[J].檢驗醫學與臨床，2019，14（5）：1225-1227.

[2]游小燕，何琦琳，劉雪芹，等.一種無血清凍存液在豬胎兒成纖維細胞上的應用研究[J].基因組學與應用生物學，2019，25（1）：69-73.

[3]白艷艷，繆競誠，張占英，等.不同凍存方法對臍血造血細胞的影響[J].蘇州大學學報（醫學版）2004;24（6）：839-840.