宮頸感染高危型人乳頭瘤病毒后microRNAs的表達及其臨床意義＊

張星瑩，楊春娜，于 慧，解水杉，孫曉娟，李連芹

盡管高危型人乳頭瘤病毒 （human papillomavirus，HPV）的持續感染是宮頸癌發病的主要原因，但宮頸癌發病是一個多因素參與、多步驟進行的慢性過程。微小 RNAs（microRNA，miRNA）是一類廣泛存在于真核生物中的小分子非編碼RNA，通過與相關靶基因結合調控基因的表達，進而參與細胞的各種生理病理過程，如細胞的增殖、分化與凋亡等。近十幾年來，miRNA在腫瘤發生、發展、復發、耐藥性等方面的作用一直是國內外學者研究的熱點問題。大量的研究表明，很多種miRNA在宮頸癌組織中的表達發生異常［1，2］，這些異常表達的 miRNA 與宮頸癌的發生、進展密切相關，甚至可以作為預測腫瘤患者預后的生物學指標［3-5］。 該研究對感染HPV16的宮頸上皮細胞 （未發生癌變或癌前病變）中miRNA的表達變化進行檢測，以探討miRNA在宮頸癌發病中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料及來源該研究獲得濱州醫學院煙臺附屬醫院醫學倫理委員會批準并取得患者知情同意。宮頸上皮組織來自因子宮肌瘤或子宮內膜異位癥接受手術治療的患者，穩定表達HPV16 E6/E7的宮頸上皮永生化細胞系（H8）購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。HPV檢測試劑盒由香港凱普公司生產，提取RNA用Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，miRNA分離試劑盒購自美國Ambion公司，SYBR Green miRNA qRT-PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1 宮頸感染HPV狀況的檢測 利用HPV檢測試劑盒測定宮頸組織的HPV感染狀況。從宮頸組織中提取RNA并通過PCR擴增，其產物與雜交膜（含有21種HPV亞型探針，其中高危型15種，低危型6種）進行雜交，雜交膜通過NBT/BCIP顯色，以確定HPV的感染與否及分型。

1.2.2 miRNA表達的微陣列分析 微陣列探針是一種寡聚核苷酸，其堿基序列與435種人類miRNA的堿基序列互補。首先從宮頸組織中提取總的RNA，再利用miRNA分離試劑盒分離出微小RNA，利用T4 RNA 連接酶進行標記，最后將含有1.5 μg的雜交液與微陣列雜交膜在42℃下雜交。次日經清洗、空干之后，利用LuaxScan 10K/A 掃描儀（北京博奧公司生產）及微陣列顯著性分析軟件（significance analysis of microarray，SAM，version 2.1）對基因芯片進行分析，以量化miRNA的表達差異。

1.2.3 實時定量PCR分析 為了驗證微陣列分析結果，利用SYBR Green miRNA qRT-PCR試劑盒對表達異常的miRNA進行定量分析。上游引物序列與待測基因的序列完全相同，下游引物是由廠家提供的通用引物。PCR反應條件為：95℃3 min，95℃15 sec，60 ℃ 1 min×40； 反 應 量 為 50 μl。 每 個miRNA的表達水平是相對于U6的相對表達量，計算公式為 2-ΔCt×106，其中 Ct代表每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數，ΔCt為每個miRNA基因與U6的閾值循環數之差，即ΔCt=（CtmiRNA-CtU6）。上述實驗重復三次。

1.2.4 統計學分析 采用SPSS 20.0統計軟件包進行分析處理，所測miRNA的表達強度以（x±s）表示。對于兩組間年齡比較，采用t檢驗法；對于miRNA表達水平的比較，采用單因素方差分析。取P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1患者一般資料該研究選取了10例單純感染HPV16的宮頸標本，其病理學檢查未見異常?；颊叩钠骄挲g（48.5±1.8）歲。另外，選取10例HPV陰性的正常宮頸作為對照，其平均年齡（49.8±1.2）歲。兩組病例的年齡無明顯差異。

2.2 miRNA的表達差異根據SAM的解釋，如果挑選表達差異在5倍以上的基因，可能會有1個基因是假陽性。而如果挑選表達差異在3～5倍之間的基因，可能會有2～3個基因是假陽性。因此，筆者挑選了表達差異在5倍以上的基因，而且這種差異出現在6個以上的所測標本中。如表1所示，在HPV16 陽性的宮頸標本中，miR-133a，miR-133b，和miR-196a的表達強度與對照組相比顯著降低。

表1 miRNA在HPV16型陽性的宮頸標本中的表達差異倍數

2.3實時定量PCR檢測結果為了驗證微陣列分析結果，筆者采用實時定量PCR對上述3個miRNA的表達進行了檢測。如圖1所示，miR-133a，miR-133b，和miR-196a在HPV16陽性的宮頸中的相對表達量顯著低于對照組，而且在H8細胞系中表達降低更加明顯。

3 討論

圖1 miRNA的表達比較

截至目前，大多數有關miRNA與腫瘤相關性的研究集中于癌癥患者或者腫瘤細胞，而miRNA在腫瘤發病起始階段的作用卻鮮見報道。在宮頸癌發病過程中，高危型HPV的致癌基因與宿主細胞的基因組發生整合是非常關鍵的一步。該研究發現了3個miRNA，其表達在感染HPV16的宮頸細胞中顯著降低。H8是一種永生化的宮頸上皮細胞，其中HPV16的E6/E7基因與宮頸上皮細胞的基因組發生了整合。miR-133a、miR-133b、miR-196a在 H8細胞系的表達進一步降低，提示這些基因與宮頸癌的發病密切相關。

眾所周知，高危型HPV持續感染是宮頸癌發病的主要因素，而HPV的致癌基因與宿主細胞的基因組發生整合是其中的關鍵步驟之一。研究發現，HPV的致癌基因與宿主細胞的基因組發生整合的位點常?？拷赾-Myc基因。之前的研究報告提出，HPV的致癌基因E6/E7和c-Myc直接作用于包括 miRNA-196 在內的多個 miRNA［6，7］，而 miRNA-196則對Hoxb8基因發揮負調節作用［8］。Hoxb8是一種重要的轉錄因子，可以調控細胞的分化［9］。因此推測HPV致癌基因與c-Myc、miR-196和Hoxb8之間，在宮頸癌的發病過程中存在相互作用關系。在該研究所確認的3個miRNA中，miR-133a和miR-133b在各種不同的腫瘤中的表達均降低。國內學者Song等研究發現，miR-133a通過表皮生長因子受體抑制宮頸癌細胞的生長［10］，而根據Patron等人的報告，miR-133b在宮頸癌細胞系HeLa細胞中具有促凋亡作用［11］。miR-133a和miR-133b在HPV16陽性的宮頸上皮細胞中的表達降低，提示此類細胞的凋亡可能受到抑制，或者有利于細胞的生長，其結果促進了HPV致癌基因的復制和整合，進而在其他因素的作用下發生癌變。其中詳細的作用機制尚需要進一步研究。