基于近紅外技術的蛹蟲草成分快速定量分析研究*

馬 健，李盡哲

（信陽農林學院，河南 信陽 464000）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又名北蛹蟲草，為子囊菌門（Ascomycota）肉座目（Gibberella fujikuro）麥角菌科（Clavicipitaceae）是一種昆蟲病原真菌。蛹蟲草在很久以前就被東方國家發現，它不僅具備很高的營養價值，還擁有珍貴的藥用功效。趙學敏在《本草綱目拾遺》中把蟲草類的藥用歸之為“能治百虛百損”；李時珍在《本草綱目》中指出，蟬花能主治“小兒天吊驚痛，夜啼，心悸”。其中蟬花包括蟬草和蛹草等多種寄生于蟬體上的蟲草。由此可見，蛹蟲草的藥用價值之高。蛹蟲草中含有腺苷、蛋白質、多糖、蟲草酸等多種有效成分，在降血脂、抗菌、抗癌、抗衰老等方面都有顯著的功效[1]。蛹蟲草與冬蟲夏草屬同屬真菌，是蟲草屬的模式種。研究結果表明，蛹蟲草含有的活性物質及其藥理作用接近甚至超過冬蟲夏草[2]。現行常用的腺苷測定方法高效液相法、蛋白質測定方法是凱氏定氮法、蟲草酸測定方法是比色法、多糖測定方法是蒽酮-硫酸法，這些方法都具有測定過程復雜、材料消耗大及分析時間長等缺點。在使用上述方法分別對蛹蟲草成分進行測定的過程中，會造成大量不可避免的損耗。而且蛹蟲草具有自然資源較少、價格昂貴、人工培養難等特點[3]，近年來，還在食品方面的開發利用上取得了很大的進展。由此，能對樣品進行無損檢測、成本低、分析速度快、效率高、能多組分同時檢測的近紅外技術進入了蛹蟲草成分研究的領域。

近紅外技術全稱叫近紅外光譜技術，近紅外光譜屬于分子振動光譜，美國試驗和材料協會（ASTM）將其定義為波長在780 nm～2526 nm范圍內的電磁波，主要反映分子中C-H，N-H與O-H基團的振動倍頻和合頻吸收。它具有易于采集和處理、吸收弱以及信息豐富等特點。近紅外光譜是人們最早發現的可見光區域，但由于吸收信號弱，譜帶重疊，解析復雜等原因，受到當時技術水平的限制，它幾乎沉睡了一個半世紀。從20世紀50年代至今，經過科學家們的不懈努力，科學技術的不斷發展繁榮，也使近紅外光譜的相關研究幾乎呈指數增長，近紅外光譜技術在各個領域得到了有效應用，并且取得了良好的社會效益和經濟效益。近紅外光譜技術在食品、藥材及化工產品領域都得到了廣泛的應用，在中藥材的成分鑒定和成分提取中具有不可取代的優點。利用近紅外技術，還能夠對中藥的產地和質量差別進行區分。基于近紅外技術，通過對蛹蟲草的成分進行快速定量分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

優質人工栽培的蛹蟲草1株，通過化學誘變法獲得278株誘變蛹蟲草菌株。各項性能長期穩定的近紅外光譜分析儀，采用SPSS軟件和Excel軟件進行數據處理與分析。

1.2 方法

采用近紅外光譜分析技術定量分析的方法，方法步驟分為三步，分別是選取代表性樣品，測量其近紅外光譜；數據采集，采用標準或認可的參考方法測定所關心的組成數據或性質數據；建模，通過合理的化學計量學方法建立數學模型。由于散射效應等因素對光譜會有干擾，為了消除影響，需要對光譜進行預處理。本研究采用FFT、卷積平滑法、一階導數、二階導數、小波變換等不同的預處理方法對光譜進行預處理。

2 結果與討論

2.1 校正集與預測集的選擇

為了取得更好的預測結果，在校正時要求試驗者適當設計校正集樣品和預測集樣品。本試驗以210株蛹蟲草樣品作為校正集，68株蛹蟲草樣品作為預測集，將兩樣品集均勻分布，校正集樣品與預測集樣品中各有效成分測定含量統計結果，見表1所示。

表1 蛹蟲草有效成分的質量含量統計Tab.1 Statistics on the quality content of active constituents of Cordyceps militaris

2.2 建立最優模型

由于在近紅外光譜分析中原始光譜會受到雜噪音和基線飄移的干擾，對蛹蟲草成分的分析效果可能不佳。為了建立最優模型，本研究采用了多種不同的光譜預處理方法，從窗口大小、尺度大小、不同寬度和不同主因子數方面對蛹蟲草的成分進行比較分析，結果見表2所示。

表2 各種預處理方法對PLS模型的影響Tab.2 Effect of various pretreatment methods on the PLS model

比較各個模型發現，各模型的內部交互驗證均方根誤差（RMSECV）、交互驗證預測值與真實值間的相交系數（RV）以及外部預測均方根誤差（RMSEP）的差別很小。保留了小數點后4位數字，才能看到細微的差別。為了建立最優模型，研究者對經過不同預處理的光譜進行了如下的選擇：FFT預處理后建立的蛋白質PLS定量分析模型的擬合效果比其他預處理后建立的模型好，RV= 0.9146，但是預測能力不如小波變換預處理后的強（RMSEPFFT= 0.6075＞RMSEP小波= 0.6018），選擇小波變換預建立蛋白質PLS定量分析模型；小波變換的腺苷定量分析PLS模型的擬合效果略高于其他預處理建立的模型，RV= 0.9771，但是預測能力不及卷積平滑法建立的腺苷PLS定量分析模型（RMSEP小波= 0.0261＞RMSEP卷平= 0.0189），選擇卷積平滑法建立腺苷PLS定量分析模型；蟲草酸在一階導數預處理后建立的PLS定量分析模型的擬合效果不是最好的，但是預測能力優于其他處理后建立的模型；蛹蟲草的多糖成分在經過卷積平滑法預處理后，不管是穩定性還是擬合效果和預測能力（RMSECV= 0.0086，RV= 0.8891，RMSEP= 0.0085），建立的PLS定量分析模型都比其他方法處理后建立的模型好。選定最優模型歸納整理后，與原始光譜建立的PLS定量分析模型比較，如表3所示。

表3 原始光譜建立的PLS模型與預處理的最優模型對比Tab.3 Comparison of the PLS model established by the original spectrum with the optimal model of the pretreatment

由表3可知，就蛹蟲草中的蛋白質成分而言，原始光譜建立的PLS定量分析模型的擬合度效果優于經過預處理后建立PLS定量分析模型（RV原= 0.9771＞RV最= 0.9083），預測能力也比經過預處理后建立的PLS定量分析模型強（RMSEP原= 0.5670＜RMSEP最= 0.6018），所以在蛋白質成分上，原始光譜建立的定量分析模型優于采用預處理方法后建立的模型；原始光譜對腺苷成分的PLS定量分析模型擬合度效果比預處理后PLS定量分析模型的擬合效果差（RV原=0.9014＜RV最= 0.9743），預測能力也不如預處理過后的PLS定量分析模型（RMSEP原= O.0203＞RMSEP最= 0.0189），因此腺苷在預處理后建立的PLS定量分析模型優于原始光譜的；蟲草酸在原始光譜建立的PLS定量分析模型中擬合度效果（RV原= 0.8807＞RV最= 0.8754）比預處理后的略好，而且預測能力（RMSEP原= 0.0082＜RMSEP最= 0.0083）也比預處理后的模型好，在蟲草酸成分的定量分析中，由原始光譜建立的模型更好些；多糖在原始光譜的PLS定量分析模型中擬合度效果（RV原= 0.8871＞RV最= 0.8819）略好于預處理后建立的PLS定量分析模型，但考慮到預測能力（RMSEP原=0.0091＞RMSEP最= 0.0085）不及預處理后建立的模型，所以預處理后的模型在多糖的定量分析上優于原始光譜建立的模型。

從上面的分析中，很難辨別蛹蟲草的成分定量分析是使用原始光譜分析建立模型好，還是需要經過預處理才能得到更好的定量分析模型。王迪等人關于近紅外光譜技術在蛹蟲草菌絲體分析中的研究認為，應用預處理方法消除了光譜中的隨機噪音、基線和其他背景干擾后，建立的PLS定量分析校正模型的穩定性、擬合效果和預測能力會有顯著提高。但是在兩者的分析效果差異不顯著的情況下，不對光譜進行預處理，直接使用原始光譜對蛹蟲草成分定量分析，會減少很多時間，提高效率和速度。

2.3 原始光譜建立模型的內部交互驗證

為了評價以原始光譜建立的模型的穩定性和擬合效果，對原始光譜建立的PLS定量分析模型進行內部交互驗證，結果見圖1所示。

圖1 原始光譜建立的模型的內部交互驗證Fig.1 Internal interaction verification of the model established by the original spectrum

從圖1中可知，多糖的內部交互驗證RMSECV為0.0091，預測值與真實值間的相交系數（RV）為0.8871，圖上的點大致均勻的分布在直線周圍并無限趨近直線。蛋白質、蟲草酸以及腺苷的數值和分布狀況也很良好，這說明預測值與真實值很接近，以原始光譜建立的PLS定量分析模型的穩定性和擬合效果非常好。

2.4 預測集原始光譜建立模型的外部驗證

外部驗證一般采用與參與定標的樣品品質相似，但是還沒有使用過的樣品，這里使用了預測集樣品，通過比較預測集樣品的預測值與試驗測定值的差異來判斷模型的預測準確性，結果見圖2。

圖2 預測集樣品原始光譜建立模型的外部驗證Fig.2 External verification of the original set model of the prediction set sample

由圖2可知，對預測集中的蛹蟲草成分不做任何預處理，利用近紅外光譜分析儀直接對它進行定量分析、建模，對建立的模型進行外部驗證， 蛋白質、蟲草酸、腺苷和多糖成分的外部預測均方根誤差（RMSEP）分別為0.0196、0.0087、0.5780、0.0079。試驗結果表明，由原始光譜建立的蛹蟲草成分定量分析模型有很好的預測能力。該結果與王迪等人的實驗結果一致[4]。

3 結論

近紅外技術可以多組分、快速、同時、準確地對蛹蟲草成分進行定量分析。可以減少用高效液相法、凱氏定氮法、比色法和蒽酮-硫酸法等分別對蛹蟲草主要有效成分進行定量分析帶來的對材料損耗大、時間長、效率低等問題，也不需要對光譜進行程序復雜的預處理。使用近紅外光譜技術定量分析蛹蟲草有效成分，能夠損耗小、更快速、更準確使蛹蟲草有效成分得到更大價值的利用，造福更多的人。