乙醇對斑馬魚胚胎發育的急性毒害效應

李愛君，張玉茹，夏雪梅，王彬容，王維香

(西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039)

乙醇(Ethanol)是一種有機化合物，俗稱酒精。酒精可以給人體帶來快感，所以酒精類飲品深受人們喜愛；但是過度飲酒會引起酒精中毒，酒精依賴，還可引發酒精相關的意外傷害、胰腺炎和胎兒酒精綜合征等疾病[1-2]。有證據表明，在大量飲酒者中，癌癥的發病率增高是由酒精的毒性所引起的。酒精可促進癌細胞生長。酒精可以成為溶劑，幫助致癌物滲入細胞膜。酒精還可通過損害肝細胞而降低肝臟的解毒力，使肝臟無法消除或滅活致癌物。大量飲酒受試者(每天大于3次)相比于不飲酒的人更易罹患5種癌癥：上消化道/呼吸道癌癥、肺癌、女性乳腺癌、結直腸腫瘤及黑色素瘤，而輕中度飲酒受試者更易患除肺癌外的其余4種腫瘤[3]。乙醇也是常見的致畸源，妊娠期間攝入乙醇對胚胎發育有嚴重影響，胎兒酒精綜合征是最主要的發育畸形，表現為頭面部畸形、發育遲緩、心血管發育障礙和中樞神經系統畸形等，這部分患兒給家庭和社會帶來了很大的負擔[4-5]。

斑馬魚(Daniorerio)是原產于印度河流的熱帶淡水魚，目前已成為世界排名第三的受科研工作者重視的模式生物，被廣泛應用于發育、藥物篩選、毒理等方面研究。斑馬魚作為模式生物的優勢很突出，具有胚胎體外授精發育，胚體透明，產卵量大，操作簡單，可重復性，成本低，便于管理等優點，并且和人類基因有著87%的高度同源性，這意味著其實驗結果大多數情況下適用于人體[6]。

為深入了解乙醇對胚胎發育的影響，本文研究了不同質量分數的乙醇對斑馬魚胚胎的致死率、孵化率、致畸率以及心包大小、心跳強弱等的影響作用，對乙醇的毒害作用進行初步評估，為乙醇對人體胚胎毒害的相關研究提供參考基礎，同時也為以斑馬魚為模型研究乙醇毒害提供依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

體形正常，魚鱗和魚鰭無破損，游動靈活，捕食敏捷的野生型斑馬魚雌雄成魚。

1.1.2 實驗試劑

95%乙醇，分析純。

1.1.3 實驗儀器

中科海斑馬魚養殖系統(青島中科海海水處理有限公司)，BCD-176DA型海爾冷藏冰箱(青島海爾股份有限公司)，恒溫培養箱(CB1350，上海皓莊儀器有限公司)，SZX10型OLYMPUS顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)Scope視屏成像系統，JA2003型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，BSA224S-CW型千分之一電子稱量天平(賽多利科學儀器(北京)有限公司)，六孔板。

1.2 方法

胚胎培養液的配制：分別稱量NaCl 3.5 g、KCl 0.05 g、NaHCO30.025 g、CaCl20.1 g，用少量純凈水溶解，再用純凈水定容至1 L。

1.2.1 處理液的配制

用95%乙醇配制10 mL質量分數分別為0.5%、1%、1.3%、1.5%、2%的乙醇，對照組采取胚胎培養液來培養。

1.2.2 實驗步驟

1.2.2.1 斑馬魚飼養

用中科海斑馬魚養殖系統養殖，保證每日14 h的光照，養殖水為至少曝氣3 d，紫外線照射殺菌，并增氧的循環水，水溫控制在(28±1)℃。成年斑馬魚每日喂食2次適合熱帶魚的營養飼料小薄片及豐年蝦，喂養后及時清理缸中的糞便。

1.2.2.2 收集胚胎

實驗前一天20:00按2:1的比例選取健康的性成熟活潑斑馬魚的雄魚和雌魚放入盛有養殖水的交配盒中，用隔板隔開，進行遮光處理。實驗當天8:00將隔板拿開，雌雄魚追逐開始產卵，并記錄產卵時間。30 min后將魚卵挑出并清洗干凈，使其無異物附著，顯微鏡下檢查是否有不合格的胚胎，即觀察胚胎是否分裂均勻或死亡。

1.2.2.3 乙醇處理

將2 hpf胚胎在顯微鏡下觀察，選擇表面光滑、分裂均勻的胚胎放入6孔板中，每孔20只胚胎，處理液5 mL，觀察胚胎暴露至96 hpf的發育情況，重復3次。每隔24 h更換新鮮處理液，同時挑出死胎。

1.2.2.4 觀察記錄

分別在24、48、72、96 hpf觀察記錄胚胎死亡情況，在48、72、96 hpf記錄胚胎孵化情況以及在72 hpf記錄胚胎的畸形率；在各處理組中隨機挑取5個個體來進行測量記錄各暴露階段斑馬魚測量指標：48、72 hpf胚胎20 s的心跳次數，72、96 hpf胚胎的體長，72 hpf胚胎的心包面積以及96 hpf胚胎眼睛背面長度。

1.2.2.5 斑馬魚胚胎細胞死亡熒光染色

將72 hpf的孵化仔魚用5 mg/L吖啶橙溶液在28.5 ℃恒溫避光染色30 min，染色結束后用胚胎培養液漂洗3次，每次漂洗5 min，直到染色劑漂洗干凈，用0.05%麻醉劑麻醉1～3 min，用熒光顯微鏡觀察斑馬魚暴露后的細胞凋亡情況，并用ImageJ測定熒光強度。

1.3 數據統計分析

用改良寇式法[7]計算72 h時的EC50(受試動物半數產生效應變化的濃度)、96 h時的LC50(受試動物半數死亡的濃度)以及IC50(受試動物半數被抑制孵化的濃度)。用Excel單因素方差分析進行處理組與對照組間的顯著性差異分析，*P<0.05，**P<0.01。用ImageJ軟件處理熒光圖片后可直接得出Area和Intden，平均密度=Intden/Area，以CK為相對值100，換算出不同濃度的處理圖片的相對熒光強度。

2 結果與分析

2.1 乙醇對斑馬魚胚胎發育的孵化、致死和致畸毒性效應

2.1.1 乙醇對斑馬魚胚胎孵化率的影響

由圖1和圖2(A)可知，對照組在48 hpf時斑馬魚胚胎開始孵化，72 hpf內全部孵化，而處理組在48 hpf并未開始孵化，從96 hpf不同處理組的孵化率可以看出隨乙醇體積分數增大，孵化率下降，胚胎的顏色加深，并呈劑量效應，表明乙醇對斑馬魚胚胎孵化有抑制作用。96 hpf時對照、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇處理的胚胎孵化率分別為100%、100%、100%、100%、90%和15%；計算乙醇對胚胎96 h-IC50為1.56%(1.35%～1.80%，95%限制范圍)。

2.1.2 乙醇對斑馬魚胚胎的致死效應

與對照組相比，隨中毒時間延長，乙醇處理組斑馬魚胚胎隨處理濃度增加死亡率上升，呈劑量效應(圖2(B))。96 hpf時對照組、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇處理的胚胎死亡率分別為15%、15%、20%、25%、30%和65%；計算乙醇對斑馬魚胚胎的96 h-LC50為1.22%(0.91%～1.63%，95%限制范圍)。

2.1.3 乙醇對斑馬魚胚胎的致畸率影響

圖1(E)顯示乙醇處理后的斑馬魚胚胎出現心包水腫、尾部打結、卵黃淤血、脊柱彎曲及不孵化，在顯微鏡中還觀察到因水腫，斑馬魚胚胎無法保持平衡，且各種表型上的畸形情況隨乙醇體積分數增加而愈加顯著。從圖2(C)得知乙醇對斑馬魚胚胎發育的致畸率隨乙醇體積分數的增加而上升。72 hpf時對照組、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇處理的斑馬魚胚胎致畸率分別為5%、35%、70%、75%、80%和100%；計算乙醇對斑馬魚胚胎的72 h-EC50為1.01%(0.77%～1.32%，95%限制范圍)。

圖1 乙醇對斑馬魚胚胎形態發育的影響(A：24hpf；B：48hpf；C：72hpf；D：96hpf；E：96hpf致畸部位)

2.2 乙醇對斑馬魚胚胎體長發育、眼睛發育和心臟發育的影響

2.2.1 乙醇對斑馬魚胚胎體長發育的影響

72和96 hpf測量斑馬魚孵化仔魚體長時，2%處理組胚胎未孵化或尾部彎曲嚴重導致無法測量。圖3(A)表明，斑馬魚仔魚體長隨乙醇體積分數增加而變短，且在實驗中發現有很多胚胎因乙醇作用而未完全孵化或造成尾部彎曲打結，該致畸作用隨處理液濃度的增大而更加顯著。乙醇體積分數達到1.3%時，乙醇對斑馬魚體長抑制作用顯著。

2.2.2 乙醇對斑馬魚胚胎眼睛發育的影響

測量96 hpf斑馬魚眼睛直徑時，因2%處理組胚胎呈未孵化狀態，無法測量；從圖3(B)可以看出，與對照組相比，處理組斑馬魚眼睛直徑更短，并且該致畸作用呈劑量效應。乙醇體積分數達到1.3%時，乙醇對斑馬魚眼睛直徑抑制作用明顯。

圖2 乙醇對斑馬魚胚胎孵化率(A)、死亡率(B)及72hpf畸形率(C)的影響

2.2.3 乙醇對斑馬魚胚胎心臟發育的影響

48 hpf時即觀察到體積分數超過1.3%的乙醇斑馬魚處理組心跳緩慢且微弱無力。測量48和72 hpf斑馬魚胚胎心跳次數，結果見圖3(C)。由圖3(C)可知，斑馬魚胚胎20 s心跳次數隨乙醇體積分數升高而減少，并呈劑量關系。48 hpf乙醇體積分數1.3%時，斑馬魚心跳與對照組相比，心跳緩慢現象明顯；而72 hpf時乙醇體積分數達到1%，斑馬魚心跳與對照相比已緩慢顯著。斑馬魚心跳次數與乙醇體積分數和處理時間均成劑量關系。測量72 hpf時斑馬魚胚胎心包面積(圖3(D))發現，與對照組相比，經乙醇處理的斑馬魚胚胎心包面積明顯增大，且呈劑量關系。在乙醇體積分數達到0.5%時，斑馬魚心包面積與對照組已有顯著差異。乙醇對胚胎心血管系統的致畸作用在許多脊椎動物中都有發現[8]。錢林溪等[9]研究發現斑馬魚胚胎循環系統對乙醇暴露非常敏感，隨著乙醇體積分數的升高，不完整的循環系統等畸形率也逐漸升高，與本研究結果類似。

注：*表示顯著；**表示極顯著

圖3 乙醇對斑馬魚胚胎體長(A)、96 hpf眼睛直徑(B)、心跳(C)及72 hpf心包面積(D)發育的影響

2.3 乙醇體積分數越高對斑馬魚的毒害作用越強

72 hpf時對胚胎進行熒光染色，從圖4可直接看出隨乙醇體積分數的增加，所染色的胚胎熒光強度增強，并且在卵黃處最強。用ImageJ軟件處理數據(見圖5)，也可直接看出相對熒光強度隨乙醇體積分數的增加而呈劑量效應。表明乙醇體積分數越高對斑馬魚的毒害作用越強。

3 結論

本研究顯示，隨乙醇體積分數增加和處理時間延長，斑馬魚胚胎的致畸率和致死率提高、孵化率降低、體長變短、以及心跳減慢。乙醇導致的斑馬魚胚胎發育致畸效應主要表現為尾部打結、眼睛變小、心包水腫、脊柱彎曲，與胎兒酒精綜合征相似。細胞凋亡研究表明，乙醇處理導致斑馬魚胚胎細胞死亡。

圖4 72 hpf斑馬魚胚胎熒光染色圖

圖5 乙醇對72 hpf斑馬魚胚胎細胞死亡的影響