Slc26a9基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究

岳春燕，劉雪梅，江仁軍

(1.宣漢縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 宣漢 636150；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

目前，在全世界范圍內(nèi)，我國(guó)胃癌發(fā)生率占據(jù)了較高的水平。在不同種類惡性腫瘤中，胃癌發(fā)病率每年新增數(shù)量達(dá)到了17%左右，死亡率達(dá)20%以上。早期診斷和治療是提高胃癌生存率有效的方法[1]。從大量臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中顯示，基因突變與基因表達(dá)是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要因素。從以往研究工作中得出，Slc26a9基因在胃癌組織當(dāng)中存在著異常表達(dá)[2]。為了進(jìn)一步明確Slc26a9基因?qū)τ诩?xì)胞增殖與胃癌等腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展所產(chǎn)生的影響，此次研究工作將該基因作為目的基因使用免疫組化、組織芯片以及細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)等多種研究方式，對(duì)其臨床意義與作用機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證和分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從在本院接受胃癌手術(shù)的患者機(jī)體中取新鮮手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行研究。在配對(duì)組織選擇中，從癌塊中取出癌組織。正常黏膜組織從距離癌塊5 cm以外的位置選取。當(dāng)標(biāo)本從患者本體上取出30 min后取材，并迅速放置到液氮當(dāng)中進(jìn)行冷凍處理，冰箱的溫度控制在-80 ℃。使用冰凍切片的方式，對(duì)癌細(xì)胞的豐富程度進(jìn)行觀察[3]。將切片中癌細(xì)胞含量超過(guò)85%的病例納入到此次研究工作當(dāng)中[4-5]。經(jīng)過(guò)最終統(tǒng)計(jì)得出，此次芯片分析組織的樣本來(lái)自于200對(duì)組織標(biāo)本，其中男性為100例，女性也為100例。患者平均年齡為(51.47±2.55)歲。另外，收集200對(duì)標(biāo)本用作實(shí)時(shí)PCR與West Blot驗(yàn)證，男性和女性均為100例。平均年齡為(51.33±2.15)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 研究工作開(kāi)展中，對(duì)研究對(duì)象的一般臨床資料進(jìn)行收集和整理，包括患者的性別、年齡。在完成之后納入初步驗(yàn)證差異表達(dá)基因篩選[6]。根據(jù)基因芯片研究所得出的結(jié)果，選擇沒(méi)有出現(xiàn)胃癌相應(yīng)研究的8個(gè)基因組織進(jìn)行初步驗(yàn)證[7]。所有的細(xì)胞株均按照各自的培養(yǎng)條件，在超凈工作臺(tái)下完成培養(yǎng)[8]。在此過(guò)程中，要由實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員協(xié)助完成操作，細(xì)胞的背景資料和培養(yǎng)條件主要分為以下幾個(gè)方面：(1)SNU-5細(xì)胞。此種上皮細(xì)胞具有懸浮和多細(xì)胞聚集生長(zhǎng)的特征。該細(xì)胞最初從一位33歲亞洲女性的胃癌轉(zhuǎn)移腹水當(dāng)中分離得出，表面的表達(dá)為TAG72與CEA。需要含有20%小牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液當(dāng)中進(jìn)行常溫培養(yǎng)。溫度控制在37 ℃，培養(yǎng)環(huán)境當(dāng)中二氧化碳濃度為5%。(2)HGC-27細(xì)胞培養(yǎng)。該細(xì)胞為上皮細(xì)胞，形態(tài)為多邊形。細(xì)胞來(lái)自HIC證實(shí)表明未分化胃癌轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)當(dāng)中分離得出。需要含有20%小牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液當(dāng)中進(jìn)行常溫培養(yǎng)。溫度控制在37 ℃，培養(yǎng)環(huán)境當(dāng)中二氧化碳濃度為5%。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，擴(kuò)增時(shí)間控制在17 h。

1.2.2 Slc26a9基因多形態(tài)分析 使用無(wú)菌方法對(duì)患者取靜脈血，1 mL至2 mL。使用酚氯仿抽提乙醇沉淀的方法，提取出基因組DNA，將DNA作為模板，可利用引物F1和R1當(dāng)行含有SNP片段，完成擴(kuò)增。當(dāng)PCR總反應(yīng)體為25 μL時(shí)，含有10倍PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL的10 μmol/L的dNTP混合液1 μL。分別取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，利用內(nèi)切酶Hind識(shí)別方法和識(shí)別位點(diǎn)GANTC完成酶切。最后，使用濃度為3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)分析Slc26a9基因在胃癌中的表達(dá)率；(2)分析Slc26a9基因SNP位點(diǎn)基因型確定于分布頻率；(3)分析Slc26a9基因不同基因型的臨床指標(biāo)，具體包括LYM、CRP、IgE、EU和EOS。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS24.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)采用χ2檢驗(yàn)，以[n(%)]表示。P<0.05為數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Slc26a9基因在胃癌中的表達(dá)

使用免疫組化方法對(duì)胃癌和癌旁組織進(jìn)行了檢查，得出了Slc26a9基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物在人體內(nèi)的表達(dá)狀況。結(jié)果顯示，Slc26a9基因在胃癌組織中呈現(xiàn)出染色包漿陽(yáng)性細(xì)胞，呈現(xiàn)出片狀或者彌漫分布的狀況，陽(yáng)性率為56.5%。高中分化中強(qiáng)度的陽(yáng)性表達(dá)較為常見(jiàn)。在正常的組織當(dāng)中，Slc26a9基因表達(dá)較為微弱，基本上處于檢測(cè)不出的狀況。少量陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)出了點(diǎn)片狀分布狀況或者散點(diǎn)分布狀況，染色輕度較比癌組織更弱[9]。研究還顯示出，患者的年齡、性別以及腫瘤位置和大小結(jié)構(gòu)等，均會(huì)在不同程度上產(chǎn)生不同的影響。不同病理參數(shù)會(huì)影響到Slc26a9基因的蛋白表達(dá)。當(dāng)患者的年齡超過(guò)了60歲時(shí)，淋巴轉(zhuǎn)移、病理分期、腫瘤分化與PCNA表達(dá)均顯示出差異，P<0.05。見(jiàn)表1。

表1 觀察組Slc26a9基因在胃癌中病理參數(shù)對(duì)照表[n(%)]

2.2 Slc26a9基因SNP位點(diǎn)基因型確定與分布頻率

使用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律進(jìn)行檢驗(yàn)，可以得出Slc26a9基因符合該定律，表明此次研究工作中所選取的基因型具有群體代表性。患者的Slc26a9基因SNP位點(diǎn)呈現(xiàn)出了3種不同的基因型[10]。分布差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.340，P=0.042)。患者AA基因型比較高。在隱性模式下，對(duì)患者的Slc26a9基因進(jìn)行分析得出差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.840，P=0.028)，但在顯性模式下，差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.700，P=0.055)。總體差異明顯，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在將胃癌患者Slc26a9基因與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析中，得出了兩組患者基因SNP位點(diǎn)3種不同基因型分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且等位基因頻率的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者SNP位點(diǎn)基因型確定與分布頻率對(duì)照表[n(%)]

2.3 Slc26a9基因不同基因型的臨床指標(biāo)對(duì)比分析

胃癌在臨床上的表現(xiàn)具有較高的異質(zhì)性，患者在診斷中，多伴有嗜酸性粒細(xì)胞比例上升的情況[11]。患者SNP位點(diǎn)不同基因型的特征指標(biāo)均有差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 觀察組Slc26a9基因不同基因型的臨床指標(biāo)對(duì)照表[n(%)]

3 討論

此研究工作采用了人類全基因組芯片，對(duì)患者胃癌組織與正常組織之間的差異基因表達(dá)圖譜進(jìn)行了分析，發(fā)掘出不同與胃癌有關(guān)的基因，其中Slc26a9基因影響最為顯著，對(duì)于胃癌發(fā)生和發(fā)展均有促進(jìn)作用。除此之外，此研究還使用了細(xì)胞系與組織表達(dá)譜，研究顯示，8株常見(jiàn)癌細(xì)胞系均在不同程度上含有Slc26a9基因表達(dá)。在胃癌組織當(dāng)中，Slc26a9基因表達(dá)水平更高，并且高于正常胃粘膜組織。進(jìn)一步驗(yàn)證了基因芯片結(jié)果的可靠性。根據(jù)腫瘤體積的亞組分析可以得出，Slc26a9基因表達(dá)和腫瘤大小有著直接關(guān)系，腫瘤大小越大，則表達(dá)越高。使用免疫組化方法對(duì)胃癌組織當(dāng)中Slc26a9基因進(jìn)行檢測(cè)，并作出蛋白表達(dá)，此表達(dá)在正常組織當(dāng)中十分微弱甚至無(wú)法檢測(cè)。但對(duì)于高、中、低分化胃癌組織中顯著表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為56.5%。進(jìn)一步結(jié)合胃癌臨床特征與病理特征可分析出，Slc26a9基因陽(yáng)性表達(dá)和年齡、病理分期、腫瘤分化、PCNA和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著顯著聯(lián)系。

本研究可看出，Slc26a9基因?qū)Π被徂D(zhuǎn)運(yùn)會(huì)產(chǎn)生影響，進(jìn)而作用于腫瘤細(xì)胞增殖中。腫瘤發(fā)生發(fā)展對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧氣均有著較高要求，在胃癌細(xì)胞代謝活動(dòng)與細(xì)胞增殖中，均與Slc26a9基因的表達(dá)量升高有關(guān)系。研究還顯示出，特異性抑制腫瘤細(xì)胞，Slc26a9基因活性抑制了正常細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，但不會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，腫瘤細(xì)胞的合成速率未受到限制。因此，在臨床治療中，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的活性，并阻斷氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)，能達(dá)到抑制癌細(xì)胞快速生長(zhǎng)與增值的效果，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)合理抗癌的目的[12-13]。

組織芯片技術(shù)在我國(guó)科學(xué)研究工作中，可單獨(dú)使用或者能與基因芯片技術(shù)進(jìn)行配合使用。此種方式在實(shí)際應(yīng)用中，能有效地完成mRNA轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增以及基因編碼產(chǎn)物檢測(cè)分析等多項(xiàng)工作。該項(xiàng)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中，具有顯著的經(jīng)濟(jì)、快速和規(guī)模性優(yōu)勢(shì)特征，能有效地完成基因檢測(cè)。在腫瘤學(xué)病理診斷研究工作中，有著十分廣泛應(yīng)用空間，并存在廣闊應(yīng)用前景。胃癌作為一種嚴(yán)重腫瘤疾病，在常見(jiàn)惡性腫瘤中排列第四位。在致死惡性腫瘤疾病中位列第二。在臨床上為胃癌患者提供根治性手術(shù)，在手術(shù)后5年之內(nèi)生存率能達(dá)到50%左右。從分子水平認(rèn)知的角度對(duì)胃癌發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行分析，尋找胃癌的特征性標(biāo)志物，是目前臨床上對(duì)胃癌疾病進(jìn)行診斷和治療的有效途徑。隨著我國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的持續(xù)發(fā)展和進(jìn)步，目前，我國(guó)已經(jīng)建立了大規(guī)模的中國(guó)胃癌人群組織芯片，為今后的胃癌機(jī)制與基因圖譜研究工作，搭建了良好的平臺(tái)[14]。本文采用免疫組織化學(xué)染色方式對(duì)Slc26a9基因進(jìn)行檢測(cè)，明確蛋白產(chǎn)物在胃癌和正常組織當(dāng)中存在的表達(dá)差異，有利于為后續(xù)進(jìn)一步研究Slc26a9基因，以及Slc26a9基因?qū)ζ渌麗盒阅[瘤疾病發(fā)生發(fā)展所產(chǎn)生的影響進(jìn)行分析。此次研究使用組織芯片技術(shù)均按照統(tǒng)一的選材標(biāo)準(zhǔn)，放置在同一張切片上。通過(guò)高通量原位分析的方式，確保了資源、時(shí)間、空間等數(shù)據(jù)指標(biāo)一致。提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

綜上所述，Slc26a9基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中有顯著上調(diào)的作用，病理組織檢測(cè)得出，該基因組織負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)的幾種氨基酸水平，在患者體內(nèi)均明顯升高，表明此種基因會(huì)影響到患者細(xì)胞增殖，參與到腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制中，產(chǎn)生促進(jìn)癌變作用。