Wnt信號(hào)通路抑制對(duì)急性白血病天門(mén)冬酰胺酶耐藥性的影響

高曉艷，劉梅，田小清，呂潤(rùn)林，魯英娟

(1.榆林市第二醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西 榆林 719000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西 西安 710032)

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是骨髓中異常的髓系原始細(xì)胞大量增殖并抑制正常造血而形成的白血病分型，在分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)上有著極大的異質(zhì)性[1]。ALL的病因非常復(fù)雜，染色體異常和可重現(xiàn)性的基因異常是ALL患者發(fā)病的主要機(jī)制，表觀遺傳學(xué)調(diào)控也是ALL的重要發(fā)病機(jī)制[2-3]。天門(mén)冬酰胺酶(Asp)治療ALL有一定的療效，但是隨著藥物的大量使用與其他因素的影響，ALL患者Asp耐藥性情況越來(lái)越多，已經(jīng)嚴(yán)重影響到了患者的治療與預(yù)后效果[4-5]。Wnt信號(hào)通路是在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，Wnt信號(hào)通路被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[6]。在ALL的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，激活Wnt信號(hào)通路可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，從而也為可為ALL的治療提供新的思路[7-8]。本文具體探討了Wnt信號(hào)通路抑制對(duì)ALL Asp耐藥性的影響，希望為明確ALL Asp耐藥的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人ALL細(xì)胞株THP-1購(gòu)自中科院武漢細(xì)胞庫(kù)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM3000、Annexin V-FITC PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；兔抗人一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP抗兔二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；siRNA陰性對(duì)照載體與Wnt siRNA載體由本實(shí)驗(yàn)室保存(構(gòu)建方法：先找靶基因干擾序列Wnt siRNA，然后是做它的反義鏈Wnt，后面加T6結(jié)構(gòu)，中間用loop環(huán)連接，在兩端加上酶切位點(diǎn))；Asp購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(用DMSO配成1.0 mM，4 ℃保存)。

1.2 細(xì)胞分組與處理

在含10.0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，培養(yǎng)箱的環(huán)境是37 ℃、5% CO2。將細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、Asp組與si-Wnt組。Asp組與si-Wnt組分別轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照載體與Wnt siRNA載體，各2 μg。對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染48 h后的各組單細(xì)胞懸液調(diào)整濃度為1×105個(gè)/mL ，培養(yǎng)于96孔板中。給Asp組與si-Wnt組細(xì)胞均加入Asp(終濃度為0.25 μM)進(jìn)行處理；對(duì)照組加生理鹽水，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行 3個(gè)復(fù)孔的設(shè)置。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期THP-1細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)時(shí)，每孔加入20 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，6 h后終止培養(yǎng)，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min后使用酶標(biāo)儀540 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)與計(jì)算增殖活性。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期THP-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×103個(gè)/mL，接種于6孔培養(yǎng)板；培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)時(shí)，將細(xì)胞采用胰酶消化，1 000 rpm×5 min離心棄上清，加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI雙標(biāo)記后，避光反應(yīng)15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，使用70%乙醇4 ℃重懸固定。PBS離心沉淀去除固定液，將50 μg/mL碘化丙啶PI添加到每毫升細(xì)胞懸液，將100 μL染色液添加進(jìn)去混勻，在4 ℃避光保存，時(shí)間為30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與計(jì)算各個(gè)細(xì)胞周期的比例。

1.6 Western-blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期THP-1細(xì)胞，胰酶消化后提取細(xì)胞的總蛋白，每組取20 μg蛋白跑SDS-PAGE膠，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行過(guò)夜封閉，剪成將對(duì)應(yīng)大小的條帶放入含有相應(yīng)一抗溶液的抗體孵育盒中(稀釋比例為1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌后，再將膜置于相應(yīng)種屬的二抗中(稀釋比例為1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌后進(jìn)行ELC顯色，檢測(cè)Wnt、GAPDH、AKT蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活情況比較

Asp加藥后24 h、48 h、72 h，si-Wnt組的細(xì)胞抑制率高于對(duì)照組與Asp組(P<0.05)。對(duì)照組在加藥后24 h和48 h的細(xì)胞抑制率低于Asp組(P<0.05)，而在加藥后72 h對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組加藥后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞抑制情況對(duì)比

*P<0.05，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05，與Asp組比較。

2.2 細(xì)胞凋亡情況比較

Asp加藥后24 h、48 h、72 h，si-Wnt組的細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組與Asp組(P<0.05)，且Asp組高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組加藥后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡情況對(duì)比

*P<0.05，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05，與Asp組比較。

2.3 細(xì)胞周期情況對(duì)比

Asp加藥后72 h，si-Wnt組的G2/M期細(xì)胞比例高于對(duì)照組與Asp組(P<0.05)，Asp組高于對(duì)照組(P<0.05)。si-Wnt組G0/G1期細(xì)胞比例低于對(duì)照組與Asp組(P<0.05)，Asp組和對(duì)照組對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組間，S期細(xì)胞比例對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組加藥后72 h的細(xì)胞周期情況對(duì)比

*P<0.05，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05，與Asp組比較。

2.4 Wnt、AKT蛋白表達(dá)對(duì)比

Asp加藥后72 h，si-Wnt組中Wnt及AKT蛋白相對(duì)表達(dá)均低于對(duì)照組與Asp組(P<0.05)，Asp組和對(duì)照組對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 3組加藥后72 h的Wnt、AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

*P<0.05，與空白對(duì)照組比較；#P<0.05，與Asp組比較。

3 討論

當(dāng)前我國(guó)白血病的發(fā)病率逐年上升趨勢(shì)，死亡人數(shù)也逐年增多。ALL是白血病的常見(jiàn)類型，多發(fā)病于成年人。雖然臨床上治療ALL的藥物比較多，但是治療效果均較差，五年生存率很難超過(guò)40 %。為了改善ALL患者的預(yù)后，深入研究ALL的發(fā)病與治療機(jī)制具有重要的價(jià)值[9]。

天門(mén)冬酰胺酶對(duì)ALL和急性單核細(xì)胞白血病有一定療效，在臨床上也應(yīng)用于治療惡性淋巴瘤。該藥能將血清中的門(mén)冬酰胺水解為門(mén)冬氨酸和氨，使得白血病細(xì)胞既不能從血中取得足夠門(mén)冬酰胺，也不能自身合成，從而抑制白血病細(xì)胞的增殖，促使其凋亡[10]。但是隨著天門(mén)冬酰胺酶的廣泛使用，天門(mén)冬酰胺酶的耐藥性越來(lái)越高[11]。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其中包含Wnt配體、Frizzled(FZD)受體、共受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白等組分，在癌癥發(fā)生、干細(xì)胞生長(zhǎng)和胚胎發(fā)育中起著重要作用[12]。Wnt基因能夠編碼結(jié)構(gòu)類似的分泌型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可參與細(xì)胞特異化和組織極化，同時(shí)參與成人組織的穩(wěn)態(tài)平衡和有絲分裂、分化等過(guò)程。Asp加藥后24 h、48 h、72 h可抑制細(xì)胞存活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Wnt通路抑制更能進(jìn)一步促進(jìn)Asp導(dǎo)致的細(xì)胞存活抑制及細(xì)胞凋亡。這表明Asp對(duì)白血病細(xì)胞具有一定的殺傷作用，但是Wnt通路抑制可以促進(jìn)這種殺傷作用。

ALL發(fā)生的確切機(jī)制目前仍尚未完全清楚，不過(guò)也是一個(gè)多基因、多階段的疾病，其病理改變涉及代謝酶、炎癥、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的變化。有研究[13]顯示在白血病細(xì)胞株中外源性過(guò)表達(dá)Wnt可以在體外有效的抑制白血病細(xì)胞的增殖，抑制白血病的發(fā)展。還有研究[14]表明Wnt過(guò)表達(dá)可以通過(guò)抑制下游靶基因介導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞G1期阻滯，從而促使細(xì)胞生長(zhǎng)受阻，還能抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力。Wnt受體結(jié)合可以刺激胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)β-catenin的核易位與穩(wěn)態(tài)。靜息狀態(tài)下，β-catenin與Axin、APC等形成β-catenin降解復(fù)合物，此時(shí)β-catenin被激酶激活成磷酸化狀況，導(dǎo)致其泛素化降解，從而使途徑激活。本研究顯示Asp加藥后72 h，G2/M期細(xì)胞比例增多，G0/G1期細(xì)胞比例降低，Wnt通路抑制可進(jìn)一步促進(jìn)這種現(xiàn)象。這提示Asp可能導(dǎo)致DNA損傷，使細(xì)胞周期阻滯，防止受損的的DNA進(jìn)入有絲分裂，對(duì)白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。而Wnt信號(hào)通路抑制可進(jìn)一步促進(jìn)此過(guò)程，表示W(wǎng)nt信號(hào)抑制可促進(jìn)Asp導(dǎo)致的細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

Wnt信號(hào)通路與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖分化、血管生長(zhǎng)、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。特別是Wnt表達(dá)量增加可導(dǎo)致Notch途徑被DNA損傷應(yīng)答激活，進(jìn)而導(dǎo)致正常細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)化。本研究顯示Asp加藥后72 h可顯著降低Wnt及AKT蛋白表達(dá)，而Wnt信號(hào)通路抑制可進(jìn)一步促進(jìn)Asp對(duì)Wnt及AKT蛋白表達(dá)的抑制作用。由此推測(cè)，Wnt信號(hào)通路抑制可通過(guò)間接下調(diào)AKT信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)對(duì)ALL細(xì)胞的殺傷作用。當(dāng)前也有研究顯示過(guò)表達(dá)Wnt能促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡和分化，抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移，可能通過(guò)激活線粒體通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究也有一定的不足，Wnt信號(hào)通路的具體作用機(jī)制還不明確，其在ALL中的明確靶基因還不清楚，將在后續(xù)研究中深入分析；且本研究沒(méi)有進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析，可能有一定的研究結(jié)論偏倚，也需要進(jìn)一步加強(qiáng)分析。

總之，Wnt信號(hào)通路抑制可降低ALL細(xì)胞對(duì)Asp的耐藥性，抑制AKT蛋白的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)ALL細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖。