探討HIF-1α途徑介導七氟烷/異丙酚對肺癌細胞惡性程度的調節作用

崔艷田，劉東亞，韓快娟

(1.漢中市人民醫院麻醉科，陜西 漢中 723000；2.西安高新醫院麻醉科，陜西 西安 710075)

肺癌是嚴重危害人類健康的臨床常見的惡性腫瘤，病程進展快，具有較高的致殘率與死亡率，常給患者家庭及社會造成巨大的生活及經濟負擔[1-2]。因此，探索肺癌細胞惡性程度的變化與發病機制是目前研究的熱點。肺癌的發病機制比較復雜，其中低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α信號通路的激活是目前研究最為深入的肺癌發生缺氧相關機制，其在膀胱癌、直腸癌[3]、前列腺癌[4]、肝癌[5]中呈高表達，可參與調節細胞周期、血管形成、腫瘤細胞代謝、轉移/侵襲、藥物抵抗等諸多生物學過程[6]。已有研究[7]顯示，HIF-1α顯著高表達于鱗狀細胞肺癌中，但是具體的作用機制尚不明確。麻醉藥物對腫瘤細胞生物學功能的影響關系到腫瘤患者術后的長期轉歸，因而探討麻醉藥對細胞惡性程度的調節作用具有重要意義。七氟烷為一種揮發性麻醉藥，不刺激上呼吸道，血氣分配系數低，起效快[8]；異丙酚為靜脈全麻常用藥物，具有代謝迅速、高脂溶性的特點[9]。本文旨在探討HIF-1α途徑介導七氟烷和異丙酚單獨或聯合使用對肺癌細胞惡性程度的調節作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

非小細胞肺癌細胞系H1299，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養(HyClone公司培養，培養條件是37 ℃、5% CO2，2 d更換1 次培養液，0.25%胰蛋白酶消化傳代)。胰酶購自Gibco公司，抗HIF-1α抗體、抗β-actin抗體購自Abcam公司。七氟烷與異丙酚購自江蘇恒瑞公司。

1.2 細胞分組與處理

將H1299細胞分為4組：空白組、七氟烷組、異丙酚組與聯合組。取對數生長期的細胞，空白組不進行處理，以PBS代替。七氟烷組加入終濃度1 nmol/L的七氟烷，異丙酚組加入終濃度1 nmol/L的異丙酚，聯合組加入終濃度均為1 nmol/L的七氟烷和異丙酚，孵育6 h后更換成正常培養基進行培養。

1.3 MTT法檢測細胞增殖率

取對數生長期細胞按照5×104個/孔傳到96孔板中，細胞處理培養24 h與36 h后，每孔加MTT 10 μL。作用4 h后，吸管洗凈培養液，每孔中加入DMS0 150 μL，振蕩培養10 min，充分混勻溶解后使用酶標儀在490 nm波長下測量吸光度值(OD)，計算細胞增殖率。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率

取對數生長期細胞1×106個/孔接種于6孔板，細胞處理培養24 h與36 h后，胰酶消化法收集細胞，用PBS緩沖液洗滌細胞3次(15 min/次)。用含有10 μL Annexinv/PI 2∶1的結合緩沖液共500 μL重懸細胞，避光冰上放置30 min，采用流式細胞儀(FACSCaliburTM)進行檢測分析細胞凋亡率。

1.5 Transwell小室檢測細胞侵襲

細胞接種于6孔板，調整細胞濃度為1×106個/孔。細胞處理培養24 h與36 h后，在侵襲實驗中，在Transwell小室上下室之間孔徑為8 μm的聚碳酸酯微孔膜上鋪上Matrigel溶液50 μL，聚合30 min后進行37 ℃平衡12 h。下室中加入600 μL常規培養基，將細胞加入上室，每室100 μL。培養24 h后室溫下甲醛固定15 min，采用0.5%結晶紫染液，計數穿過濾膜的細胞。

1.6 Western blot檢測蛋白表達

細胞處理培養24 h與36 h后，取所有細胞，加入適量細胞裂解液，冰上放置30 min，4 ℃、12 000 rpm離心10 min，取上清。將樣品(20 μg)加入到SDS-PAGE加樣孔內進行電泳，電泳后進行PVDF膜轉膜，封閉2 h，分別加入抗HIF-1α抗體(1∶500)、抗β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，洗膜，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)，室溫孵育120 min，洗膜、顯影后掃描儀成像，采用自動成像系統分析。

上述所有實驗都重復3次，取3次實驗的平均值作為結果數據。

1.7 統計學分析

選擇SPSS 18.00軟件對本研究所有數據進行分析與處理，對各組數據首先進行正態性檢驗，兩組計量資料間的比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖率對比

細胞處理培養24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯合組的細胞增殖率顯著低于對照組(P<0.05)，聯合組亦低于七氟烷組及異丙酚組(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖率對比

*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與異丙酚組比較；△P<0.05，與七氟烷組比較。

2.2 細胞凋亡率對比

細胞處理培養24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯合組的細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)，聯合組亦分別高于七氟烷組和異丙酚組(P<0.05)。見表2。

2.3 細胞侵襲率對比

細胞處理培養24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯合組的細胞侵襲能力顯著低于對照組(P<0.05)，聯合組亦分別低于七氟烷組與異丙酚組(P<0.05)。見表3。

表2 各組細胞凋亡率對比

*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與異丙酚組比較；△P<0.05，與七氟烷組比較。

表3 各組細胞侵襲能力對比

*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與異丙酚組比較；△P<0.05，與七氟烷組比較。

2.4 HIF -1α表達水平對比

細胞處理培養24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯合組的細胞HIF-1α相對表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，聯合組亦分別低于七氟烷組與異丙酚組(P<0.05)。見表4。

表4 各組細胞HIF-1α相對表達水平對比

*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與異丙酚組比較；△P<0.05，與七氟烷組比較。

3 討論

肺癌是目前世界上發病率最高的惡性腫瘤之一，其早期診斷困難，缺乏特異性治療手段，使得患者的死亡率一直居高不下。惡性腫瘤在生長和發展過程中，不受控制地過度生長使耗氧量顯著增加，因此肺癌機體普遍存在低氧微環境，可促進肺癌細胞的生長和轉移[10]。而乏氧腫瘤細胞對于放射線抵抗，是造成腫瘤治療后復發與放療失敗的原因之一。當腫瘤細胞處于缺氧狀態，會激活細胞的低氧應激反應信號轉導途徑，激活HIF-1α的表達。HIF-1α作為這一環節的重要轉錄調節因子，可成為當前腫瘤治療研究的重要靶點之一[11]。

七氟烷和異丙酚為經典的代表性吸入全麻與靜脈全麻藥物，具有起效快、時效短、蘇醒迅速等特點。本研究顯示，細胞處理培養24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯合組的細胞增殖率、侵襲能力均顯著低于對照組，細胞凋亡率亦顯著高于對照組，聯合組與七氟烷組、異丙酚組對比，差異亦有統計學意義。這表明，七氟烷、異丙酚的應用都能促進肺癌細胞凋亡，抑制其增殖與侵襲，而兩者的聯合使用可發揮協同作用。另有研究[12]顯示，七氟烷、異丙酚可呈劑量依賴性地促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，可增加腫瘤細胞對放療的敏感性，從而發揮抗腫瘤作用。

缺氧條件是肺癌發生與發展過程中強有力的驅動因素，缺氧可誘導細胞代謝功能的改變，導致增加放療、化療抵抗能力。HIF-1是由α、β亞基構成一種低氧信號傳遞因子，低氧環境可誘導HIF-1α穩定表達，與HIF-1β形成二聚體后可參與調控腫瘤細胞增殖和轉移[13]。已有研究[14]顯示，HIF-1α與腫瘤的侵襲、轉移、生長、增殖密切相關，是調節腫瘤細胞適應低氧的核心轉錄因子。miRNA沉默HIF-1α表達可以抑制Survivin基因的表達，進而抑制肺癌細胞生長，提示HIF-1α是參與調控凋亡相關基因表達的重要轉錄因子。另外，還有研究[15]顯示，HIF-1α在神經膠質瘤中呈現高表達狀況，且與患者的不良預后密切相關，可作為評價神經膠質瘤患者的預后的獨立預測因子。本研究指出，細胞處理培養24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯合組的細胞HIF-1α相對表達水平顯著低于對照組，聯合組亦低于七氟烷組與異丙酚組，表明麻醉藥物的應用能抑制HIF-1α的表達。麻醉藥物的聯合使用可有效抑制HIF-1α的表達，從而發揮更好的抗腫瘤作用。目前，也有研究[8]顯示異丙酚可顯著抑制低氧誘導的肺癌細胞轉移能力，且作用機制可能與激動α2腎上腺素能受體有關。此外，研究[9]顯示，肺損傷大鼠接受七氟烷處理后，肺癌組織HIF-1α表達水平下調，提示七氟烷具有抑制肺損傷上HIF-1α通路活性和侵襲力的作用。

總之，七氟烷和異丙酚都可抑制HIF-1α途徑的激活，從而發揮對肺癌細胞惡性程度的抑制作用，且七氟烷和異丙酚的聯合應用具有協同作用。