高效液相體積排阻色譜法測定口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量及疫苗質量評估

朱元源，徐嫄，鄒興啟，楊延麗，劉麗麗，萬建青，李翠，徐璐，張乾義，夏應菊，王兆，郎洪武，王琴，張松平，趙啟祖

高效液相體積排阻色譜法測定口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量及疫苗質量評估

朱元源1，徐嫄1，鄒興啟1，楊延麗2，劉麗麗2，萬建青1，李翠1，徐璐1，張乾義1，夏應菊1，王兆1，郎洪武1，王琴1，張松平2，趙啟祖1

（1中國獸醫藥品監察所，北京 100081；2中國科學院過程工程研究所/生化工程國家重點實驗室，北京 100190）

口蹄疫疫苗質量評價方法對疫苗生產企業和監管部門進行質量控制尤為重要，146S抗原含量是評價口蹄疫疫苗質量的關鍵指標。蔗糖密度梯度離心法（sucrose density gradient centrifugation，SDGC）是公認經典的測定口蹄疫146S抗原含量的方法，但存在檢測耗時長、過程復雜、重復性差等缺點，影響了疫苗的質量監測。口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量高效液相體積排阻色譜法（size-exclusion high-performance liquid chromatography, SE-HPLC）是一種簡便、快速、自動化程度高、高效的測定方法。【】在初步建立的采用SE-HPLC測定口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量方法的基礎上，針對不同類型、不同濃縮純化生產工藝制備的口蹄疫滅活疫苗，進一步確認SE-HPLC法在檢測過程中的普適性勢在必行。利用口蹄疫146S抗原標準品建立SE-HPLC法標準曲線，求得回歸方程，用于檢測樣品的146S含量。采用SE-HPLC法和SDGC法分別檢測146S抗原標準品1倍、2倍、4倍、8倍、16倍稀釋的5個樣品和市場上隨機選取的22批疫苗， 計算146S抗原含量，對比分析兩種方法的相關性。用SE-HPLC法，3次重復檢測不同企業生產的134批口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量，通過色譜圖特異性、檢測值相對標準偏差（relative standard deviation ，RSD）分析SE-HPLC法的重復性，評價該方法的適用性，分析市場流通疫苗的總體質量情況。SE-HPLC法建立的標準曲線，峰面積與146S抗原含量的線性關系良好（2=0.9981，=8）。口蹄疫146S抗原標準品5個稀釋樣品和22批口蹄疫疫苗的146S抗原含量檢測結果表明，口蹄疫146S抗原含量檢測SDGC法和SE-HPLC法高度正相關（R2=0.9994，S=5；R2= 0.9602，v=22）。134批口蹄疫滅活疫苗中，146S抗原含量相對標準偏差5%的疫苗批次分別占疫苗總批次（134批）、單價苗總批次（18批）、雙組分及雙價苗總批次（76批）、三價苗總批次（40批）的81.34%、72.22%、85.53%、80.00%；146S抗原含量相對標準偏差≤10%的疫苗批次占疫苗總批次（134批）的97.76%。口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法檢測重復性良好，其中疫苗146S抗原含量2—4μg·mL-1時，檢測重復性最好。所有批次疫苗均檢測到目的峰，目的峰的平均起峰、最高峰、落峰時間分別為SE-HPLC法進樣后的11.58、12.90、14.93min，平均持續3.36min。134批口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量為1.11—80.36μg·mL-1，其中單價苗、雙價苗、雙組分苗、三價苗146S抗原含量均值分別為2.07、2.40、2.85、13.14 μg·mL-1。口蹄疫滅活疫苗146S 抗原含量SE-HPLC法適用性好、重復性高、高效、快速、簡便，能夠用于檢測不同類型的口蹄疫滅活疫苗，從而進行疫苗的質量監測和評估。市場流通的口蹄疫滅活疫苗146S含量較高，疫苗質量較好。

高效液相體積排阻色譜法；口蹄疫滅活疫苗；146S；疫苗質量

0 引言

【研究意義】隨著我國口蹄疫疫苗懸浮培養生產工藝的普及、濃縮純化技術的提高，以及疫苗質量新標準的頒布，制造優質、高效口蹄疫疫苗已成為大勢所趨。國內口蹄疫疫苗生產企業制備工藝不同，疫苗質量良莠不齊，缺乏穩定、可靠的疫苗質量評價方法是主要原因之一，口蹄疫疫苗質量的評價方法對生產企業、養殖戶以及疫苗監管部門都具有重要意義。【前人研究進展】動物攻毒試驗是目前評價口蹄疫疫苗質量的最重要的方法之一[1-4]。但該方法存在檢測周期長、成本高昂、陰性動物難以獲得等缺點，難以用于疫苗質量控制。因為口蹄疫病毒完整病毒粒子146S具有最強的免疫原性，是影響疫苗免疫效果的關鍵要素[5-6]，所以146S抗原含量的檢測是體外評價疫苗質量的關鍵，是國際口蹄疫疫苗庫儲備抗原的重要指標，也是大型疫苗生產企業除疫苗種毒免疫原性、內毒素含量、雜質蛋白含量外最受關注的指標。蔗糖密度梯度離心法[7-9]是目前公認傳統經典的檢測口蹄疫146S抗原含量的方法，但該方法檢測過程復雜、不同單位檢測重復性差，且耗時、耗力，從而制約了技術的推廣。近十余年來，中國獸醫藥品監察所探索了不同的方法和策略評估口蹄疫疫苗質量，包括免疫印跡，單抗夾心ELISA，超速離心、蔗糖密度梯度離心等方法，均不能滿足口蹄疫146S抗原含量檢測特異性、重復性、普適性等要求。為了解決口蹄疫146S定量檢測存在的問題，國內外學者開發了其它定量測定口蹄疫病毒粒子的方法。有研究者通過制備級體積排阻色譜將口蹄疫疫苗中的146S與其它雜質分離，采用紫外檢測器檢測其特征吸收峰，并經過對比，證明體積排阻色譜檢測結果與蔗糖密度梯度離心具有一致性[10]。在此基礎上又發展出采用高效體積排阻色譜法測定146S抗原含量的技術，通過高效液相色譜系統及分析色譜柱可進行自動化、高通量、高靈敏度的測定[11]。經過中國獸醫藥品監察所的研究，該方法已初步應用于市售口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量的定量測定[12-13]。鑒于口蹄疫滅活疫苗生產工藝復雜，抗原或疫苗破乳水相中殘存的宿主細胞DNA等干擾物容易干擾SE-HPLC法目的峰的特異出現。可通過在抗原色譜分離前應用核酸內切酶進行酶切處理，從而排除干擾，準確測定[10-11]，拓寬該方法的適用性。但該方法對大規模疫苗樣本的檢測應用效果未知，是否適用于國內不同企業生產的不同類型疫苗的檢測也未知。【本研究切入點】利用SE-HPLC法和SDGC法分別檢測口蹄疫146S抗原標準品1、2、4、8、16倍稀釋的5個樣品和市場上隨機選取的22批疫苗， 計算146S抗原含量，對比分析兩種方法的相關性。采用改進的SE-HPLC法，3次重復檢測不同企業生產的134批口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量，驗證該方法的重復性、普適性、特異性，并初步評價市售疫苗的質量。【擬解決的關鍵問題】本研究進一步驗證了口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法與蔗糖密度梯度離心法的高度相關性，制訂了國內口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量SE-HPLC法測定的操作規程，為使用該方法進行檢測的操作人員及數據統計分析人員提供具體的技術指標及參數，推動了該方法在全國范圍的普及和應用，為快速、高效、便捷的進行口蹄疫滅活疫苗制備全過程監管提供了技術策略，為開展口蹄疫滅活疫苗質量評估提供路徑。

1 材料與方法

本試驗于2018年4月至2019年4月在中國獸醫藥品監察所標準物質研究室完成。

1.1 疫苗、有機試劑及酶

疫苗：口蹄疫滅活疫苗134批，包括單價苗18批，雙價苗及豬雙組分苗76批，三價苗40批。A型、Asia1型、O型PD50均大于10.05。有機試劑：正戊醇（北京化工公司）。酶：核酸酶Benzonase Nuclease（Novagen公司）。

1.2 色譜柱、色譜儀及色譜條件

色譜柱：基質為親水修飾的硅膠基質高效液相體積排阻色譜柱，孔徑45—50nm，TSKgel G4000SWXL （7.8 mm×30 cm）（TOSOH公司）；保護柱：TSKgel guard column SWXL（6.0 mm×4 cm）（TOSOH公司）。色譜儀：高效液相色譜儀L-2000 型（Hitachi 公司）；流動相：pH 7.2—7.4的50 mmol·L-1磷酸緩沖液，含 0.1 mol·L-1Na2SO4，0.2μm濾膜過濾脫氣處理。色譜條件：高效液相色譜儀配備的紫外檢測器檢測波長：259nm，流速：0.6mL·min-1，進樣量：100μL，采集時間：30min。

1.3 標準曲線的制備

用pH 7.2—7.4的50 mmol·L-1磷酸緩沖液將濃度為60 μg·mL-1146S抗原標準品進行系列稀釋，HPLC進樣檢測。采用系統自動積分146S在259 nm下的峰面積，以峰面積為橫坐標，相應146S濃度為縱坐標，在EXCEL程序中繪制線性趨勢線作為標準曲線，線性回歸方程應達到2＞0.990。

1.4 疫苗破乳

分別吸取疫苗1 350 μL與正戊醇150 μL，至同一2 mL離心管中，充分振蕩使其破乳。4℃靜置1 h后3 000 r/min，4℃，離心10min，用注射器緩慢插入底部吸取底層水相，轉移至新的離心管中，再3 000 r/min，4℃，離心10min，用注射器緩慢吸取下層清亮水相抗原200μL。

1.5 抗原水相處理

加入Benzonase酶 0.5μL，室溫下200r/min振蕩反應1h后，3 000 r/min，4℃，離心10min，吸取150μL透明水相至色譜瓶，按照HPLC色譜條件HPLC進樣檢測。

1.6 146S含量的計算

HPLC法檢測過程中，檢測樣品色譜圖中146S特征峰保留時間在11—16min。對259 nm下的146S峰面積積分，得檢測樣品146S峰面積，將峰面積代入標準曲線，即得146S在每mL破乳水相中的濃度。由于疫苗制備是根據佐劑ISA 206與水相抗原質量比1:1進行乳化，根據二者密度計算，應將測定結果乘以體積系數0.46，即得每mL油佐劑滅活疫苗中146S濃度（μg·mL-1）。

1.7 相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分析

每批疫苗樣品的146S抗原含量，采用SE-HPLC法進行3次重復檢測，計算相對標準偏差（RSD）。

1.8 蔗糖密度梯度離心法（sucrose density gradient centrifugation，SDGC）

制備 15%—45%均勻線性蔗糖梯度，將破乳水相進行蔗糖密度梯度超速離心，利用紫外分光光度計檢測OD259nm值，根據公式計算 146S的含量[7]。

1.9 高效液相體積排阻色譜法與經典方法蔗糖密度梯度離心法比對

將口蹄疫146S抗原標準品用磷酸緩沖液做1、2、4、8、16倍稀釋，對稀釋后的146S抗原標準品分別用146S抗原含量SE-HPLC法與SDGC法檢測。隨機選取22批疫苗，進行146S抗原含量 HPLC法和SDGC法檢測。根據146S抗原含量檢測結果，通過統計學分析，驗證146S抗原含量SE-HPLC法與SDGC法檢測的相關性、有效性和可行性。

2 結果

2.1 標準曲線及標準色譜峰

將146S 抗原標準品系列稀釋樣品的色譜峰面積與濃度進行線性回歸處理，得到146S的回歸方程為：=64409- 80431，2=0.998，具有良好的線性關系（圖1）。146S抗原標準品在高效液相色譜儀中顯示出特征性色譜峰，146S 抗原出峰時間為11—16min，最高峰的保留時間為12.947min（圖2、3）。

2.2 口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量SE-HPLC法與SDGC的檢測比對

2.2.1 口蹄疫146S抗原標準品兩種方法的比對 將口蹄疫146S抗原標準品用磷酸緩沖液做1、2、4、8、16倍稀釋，對稀釋后的146S抗原標準品分別用SE-HPLC法與SDGC法檢測（表1）。

圖1 口蹄疫滅活疫苗146S抗原定量分析標準曲線

圖2 口蹄疫146S抗原標準品檢測色譜圖

表1 口蹄疫146S抗原標準品SE-HPLC法與SDGC法檢測比對

圖3 口蹄疫146S抗原標準品原始濃度色譜圖

以口蹄疫146S抗原標準品SE-HPLC法測定的146S抗原含量為橫坐標x，SDGC法測定的146S抗原含量為縱坐標y，通過統計分析方法，得到線性回歸方程為：y=0.6401 x+ 0.4640，相關系數R2= 0.9994，P＜0.05（P=6.07E-06），T檢驗差異顯著。2越接近1說明回歸線擬合程度越好，y與x相關程度越高。P＜0.05說明兩組數據差異顯著。統計分析結果表明：y與x線性關系顯著，高度正相關，即口蹄疫146S抗原標準品檢測SDGC法和SE-HPLC法高度正相關。

2.2.2 22批口蹄疫滅活疫苗兩種方法的比對 隨機選取22批口蹄疫滅活疫苗，分別采用 SE-HPLC法與SDGC進行146S抗原含量測定（表2）。以22批口蹄疫滅活疫苗SE-HPLC法測定的146S抗原含量為橫坐標x，SDGC測定的146S抗原含量為縱坐標y，通過統計分析方法，得到線性回歸方程為：=0.6019 x+0.4809，相關系數R2= 0.9602，P＜0.05（P=9.26E- 15），T檢驗差異顯著。統計分析結果表明：y與x線性關系顯著，高度正相關，即口蹄疫滅活疫苗146S抗原檢測SDGC法和SE-HPLC法高度正相關。

表2 口蹄疫疫苗146S抗原含量檢測SE-HPLC法與SDGC比對

綜上所述，口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法和SDGC法高度正相關。口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法測定的146S抗原含量是SDGC法的1.02—2.10倍，146S抗原含量越高，差異越大；口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法重復性好。

2.3 SE-HPLC法檢測重復性及適用性

采用口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法檢測134批口蹄疫滅活疫苗，包括單價苗18批、雙組分苗及雙價苗76批、三價苗40批，每批疫苗進行3次重復測定，計算檢測的相對標準偏差（表3）。采用核酸酶處理后再進行SE-HPLC檢測的方法均能檢測到疫苗中完整的146S特征峰，表明該方法具有良好的適用性，對不同企業的不同類型疫苗均能進行檢測。每個樣品通過SE-HPLC法3次重復性檢測分別得到3個146S含量數值（μg·mL-1），其中146S抗原含量相對標準偏差＜5%的批次分別占疫苗總批次（134批）、單價苗總批次（18批）、雙組分及雙價苗總批次（76批）、三價苗總批次（40批）的為81.34%、72.22%、85.53%、80.00%；相對標準偏差10%的疫苗批次占疫苗總批次（134批）的97.76%。結果表明，口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法重復性高，其中三價苗、單價苗的檢測重復性高于雙組分苗及雙價苗的檢測重復性。

表3 口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量SE-HPLC法檢測重復性分析

2.4 口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量分析

根據以上分析，口蹄疫疫苗146S抗原含量SE-HPLC法具有重復性高、適用性強的優點，可用于市售不同疫苗的質量監測。采用該方法對目前國內市售的疫苗質量進行評估，結果見表4。134批口蹄疫滅活疫苗中，疫苗146S抗原含量（Y，μg·mL-1）均值Y＞2、Y＞4、Y＞6的疫苗批次分別占疫苗總批次的73.88%（99/134）、33.58%（45/134）、22.39%（30/134），146S抗原含量均值最低為1.11μg·mL-1，均值最高為80.36μg·mL-1。其中單價苗抗原146S含量（μg·mL-1）平均值Y＞2的疫苗批次占單價苗總批次的61.11%（11/18），雙組分苗抗原146S含量平均值Y＞4μg·mL-1的疫苗批次占雙組分苗總批次的23.08%（9/39），三價苗抗原含量146S平均值Y＞6μg·mL-1的疫苗批次占三價苗總批次的60.00%（24/40）。單價苗、雙價苗、雙組分苗、三價苗的146S抗原含量（μg·mL-1）均值為2.07、2.40、2.85、13.14，平均每個毒株的146S抗原含量（μg·mL-1）：三價苗＞單價苗＞雙組分苗＞雙價苗。疫苗146S抗原含量（Y，μg·mL-1）2≤Y≤4時，檢測相對標準偏差小，檢測重復性高。

2.5 口蹄疫滅活疫苗146S目的色譜峰特征性指標

選取134批疫苗，共計檢測樣品402個，其目的色譜峰的平均起峰、最高峰、落峰時間為SE-HPLC進樣后的11.58、12.90、14.93min，平均持續3.36min。疫苗樣品色譜峰的最早起峰、最早落峰時間為11、16min，目的色譜峰的持續時間為2.5—5min。

表4 口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量及檢測分析

2.6 口蹄疫滅活疫苗的典型色譜曲線分析

疫苗破乳水相樣品，在色譜分離之前，應用核酸內切酶Benzonase進行酶切處理，徹底進行核酸酶消化，以排除宿主細胞DNA等的干擾，避免與146S目的峰交叉的干擾峰或異常峰出現。酶處理后（圖4）干擾物消除明顯，保證了目的峰的特異性（11—16 min）以及146S抗原含量檢測的準確性。

3 討論

口蹄疫病毒顆粒為球形，直徑為27—30nm，病毒粒子無囊膜，呈二十面體對稱的顆粒。其蛋白衣殼包裹基因組RNA組成完整病毒粒子，有60個VP1、VP2、VP3和VP4結構蛋白分子組成，其中表面結構蛋白VP1、VP2和VP3立體結構位于病毒粒子表面，VP4位于內部[14]。口蹄疫完整病毒粒子在蔗糖梯度中的相對沉降系數為146S，完整病毒顆粒146S或75S空衣殼在酸性、堿性或一定溫度條件下降解為12S和5S粒子，降解后的小分子無免疫原性[6,15-19]。因此口蹄疫滅活疫苗的質量控制關鍵在于監測完整病毒粒子146S而不受降解的12S的干擾，且SE-HPLC檢測方法本身不會導致不穩定的146S發生損失。

過去30多年， Barteling開發的146S蔗糖密度梯度離心法提供了一個可靠的病毒濃度測定方法[7]。該方法將樣品上樣于均勻分布的15%—45%蔗糖密度梯度上層，然后進行超速離心。但連續蔗糖密度梯度的制備需要純手工配制或用簡單的梯度混合器，后期紫外分光檢測過程和人為因素影響較大，整個操作過程關鍵環節多，造成樣品檢測重復性差、周期長、人力成本和運行成本較高。口蹄疫146S高效液相體積排阻色譜法依據口蹄疫病毒粒子的物理性狀而建立，口蹄疫滅活疫苗生產過程中半成品及成品疫苗中病毒顆粒和其他紫外吸光分子大小差異顯著，不同分子組分進入分子篩時，大分子不能進入顆粒內部，先于小分子被流動相洗脫至柱外，各組分按照分子尺寸大小先后洗脫，起到分離和純化的作用。該方法由Spitteler等[11]于2011年首次建立，因其高效、快速、便捷等優勢引起重視。阿根廷口蹄疫疫苗制造商BIOGENESIS-BAGO S.A.公司開發SE-HPLC法并用于口蹄疫疫苗生產和質量控制，專利申請已在阿根廷、巴西、美國和中國歸檔[20-22]。中國科學院過程工程研究所率先在國內開發該方法并驗證[23-24]，目前與中國獸醫藥品監察所聯合負責該方法的改進和應用[12-13]。SE-HPLC定量檢測146S和多角度激光散射定性檢測146S病毒顆粒大小配合，被推薦用于口蹄疫滅活疫苗中間產品和終產品檢測[10]。雖然口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法與SDGC法原理不同，但都是通過理化特性測定抗原含量。口蹄疫146S抗原標準品1倍、2倍、4倍、8倍、16倍稀釋的5個樣品和22批口蹄疫疫苗的146S抗原含量檢測結果表明，口蹄疫146S抗原含量檢測SDGC法和SE-HPLC法高度正相關（R= 0.9994，n=5；R=0.9602，n=22），22批口蹄疫疫苗146S抗原含量檢測SE-HPLC法檢測值均比SDGC法檢測值高（表1、2），差異顯著，前者測定的146S抗原含量是后者的1.02—2.10倍。

前表示加酶處理前；后表示加酶處理后

迄今我國有七家口蹄疫滅活疫苗生產企業，各企業均已實現懸浮培養技術制備抗原、超速離心和中空纖維柱等濃縮純化工藝進行改進，但詳細工藝不統一，由此制備的疫苗抗原中所含的穩定劑、鹽離子等成分不同[25-28]，導致在大規模使用SE-HPLC方法時出現干擾峰（圖5-加酶處理前）。本研究所用的SE-HPLC方法已進行過改進和優化（圖4-加酶處理后），制備的口蹄疫146S抗原標準品保證了檢驗的一致性和準確性。口蹄疫146S目的色譜峰特征性指標的收集便于研究者或使用者在具體運用該方法操作時參考執行。134批市售口蹄疫滅活疫苗中，SE-HPLC法檢測的146S抗原含量相對標準偏差（RSD）RSD≤10%的疫苗批次占97.76%，檢測重復性好（表2）；疫苗146S含量2—4μg·mL-1時，檢測相對標準偏差最小（表3）；單價苗、雙價苗、雙組分苗、三價苗均成功采用SE-HPLC法進行了檢測。以上結果表明該檢驗方法具有普適性、重復性、一致性。

國家中長期動物疫病防治規劃(2012—2020年)中將我國部分地區列為口蹄疫免疫無疫區。制備和提供穩定、優質、高效、純凈的口蹄疫疫苗成為防控該病和實現目標的關鍵。在對SE-HPLC監測的準確性和適用性進行檢驗后，對134批口蹄疫滅活疫苗抗原146S含量進行檢測。所有抽檢疫苗146S含量（Y，μg·mL-1）均值Y＞2占73.88%，說明口蹄疫疫苗總體質量較好；所有類型疫苗包括單價苗、雙價苗、雙組分苗、三價苗的抗原146S含量μg·mL-1均值分別為2.07、2.40、2.85、13.14μg·mL-1，不同類型疫苗抗原濃度均高于2 μg·mL-1。根據口蹄疫滅活疫苗質量標準，成品疫苗大多規定每頭份口蹄疫146S抗原含量高于0.9μg·mL-1。臨床免疫時，牛每頭注射1—3mL，羊每頭份注射0.5—1mL，豬每頭份注射1—2mL，134批疫苗成品檢測結果顯示146S抗原含量符合相應的質量標準要求[29]。目前，我國口蹄疫疫苗檢驗項目須按OIE標準增加純度檢驗項目[1]，以便實現口蹄疫感染與免疫的鑒別診斷[30-33]，實現 OIE口蹄疫無疫認證的標準，這對口蹄疫滅活疫苗的質量標準提出了更高要求。口蹄疫疫苗146S抗原含量SE-HPLC法具有簡便、高效、快速等特性，適用于口蹄疫疫苗生產企業全過程的質量監測和終產品檢測，有助于進一步提升我國口蹄疫疫苗質量，進而推動整個產業鏈水平的提高，為我國重大動物疫病防控提供切實可行的技術支撐。

4 結論

4.1 口蹄疫滅活疫苗完整病毒粒子（146S）高效液相體積排阻色譜法是一種快速、高效、便捷的定量檢測有效抗原含量的方法，適于不同生產工藝制備的不同類型的口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量測定。

4.2 不同生產企業生產的134批口蹄疫滅活疫苗，疫苗146S抗原含量全部符合質量標準要求，其中146S抗原含量大于2μg·mL-1的占73.88%，疫苗質量普遍較高。

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Determination of 146S Antigen in Inactivated Foot-and-Mouth Disease Vaccine by Size-exclusion High-performance Liquid Chromatography and Quality Evaluation of Vaccine

ZHU YuanYuan1, XU Yuan1, ZOU XingQi1, YANG YanLi2, LIU LiLi2, WAN JianQing, LI Cui1, XU Lu1, ZHANG QianYi1, XIA YingJu1, WANG Zhao1, LANG HongWu1, WANG Qin1, ZHANG SongPing2, ZHAO QiZu1

（1China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081;2National Key Laboratory of Biochemical Engineering/Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190）

【】As vaccine manufacturers and regulatory departments, the quality evaluation method of foot-and-mouth disease (FMD) vaccine is particularly important in quality control, where the 146S antigen is the key index. For the quantification of 146S antigen in FMD vaccine, sucrose gradient density centrifugation (SGDC) is recognized as a classical method but the process is complex, time-consuming and poorly repeatable, which affect the quality monitor of vaccines. Size-exclusion high-performance liquid chromatography (SE-HPLC) is previously reported as a simple, rapid, highly automated and efficient technology for analysis of 146S content. 【】A method of 146S antigen determination in inactivated FMD vaccine by SE-HPLC has been preliminarily established. However, the applicability, repeatability and effectiveness of this method are unknown in the FMD vaccines produced by different manufacturers with different concentration and purification processes. Hence, it is imperative to confirm the universality of the SE-HPLC method.【】Here, the standard curve and regression equation of SE-HPLC method were established with FMD 146S antigen standard, which were used for 146S antigen detection of samples. Moreover, using five samples with 1, 2, 4, 8 and 16 times dilution of 146S antigen standard and 22 batches of vaccine randomly selected in the market, the 146S antigen was detected by SE-HPLC and SDGC respectively, and the correlation between the two methods was analyzed. Further, 134 batches of inactivated FMD vaccines products from different manufacturers in the market were detected three times each for 146S content by SE-HPLC. By analysis of chromatogram specificity of SE-HPLC method and relative standard deviation of 146S content, we confirmed its repeatability and reliability in evaluating all types of vaccine. Finally, 146s content was operated for the quality of FMD vaccines in the market. 【】The standard curve of SE-HPLC method showed good linearity between peak area and concentration of FMD 146S antigen standard (2=0.9981,=8).The detection results of 146S content in 5 diluted 146S antigen standards and 22 batches of FMD vaccine demonstrated that there was a highly positive correlation between SDGC and SE-HPLC methods (R2=0.9994,S=5;R2= 0.9602,v=22). Among 134 batches of vaccines, the vaccine batches with 146S content relative standard deviation RSD＜5% accounted for 81.34%, 72.22%, 85.53% and 80.00% of the total vaccine batches (134 batches), total monovalent vaccine batches (18 batches), total bicomponent and bivalent vaccine batches (76 batches) and total trivalent vaccine batches (40 batches), respectively. The vaccine batches with 146S content RSD≤10% accounted for 97.76% of the total vaccine batches (134 batches). The SE-HPLC method for detection 146S content in FMD vaccines performed good repeatability, and best repeatability appeared in 2-4μg·mL-1146S content of the vaccines. Target peaks could be detected in all batches of vaccine, the average peak starting time, peak and peak falling time of objective chromatographic peaks were 11.58 min, 12.90 min and 14.93 min after HPLC sampling. The average retention of peak was 3.36min. The average 146S content was 1.11-80.36μg·mL-1in all vaccines, 2.07 μg·mL-1in monovalent vaccines, 2.40 μg·mL-1in bivalent vaccines, 2.85 μg·mL-1in bicomponent vaccines and 13.14 μg·mL-1in trivalent vaccines respectively.【】These results provided proof that SE-HPLC assay was universal, highly repeatable, reliable, rapid and simple for detection 146S content in various types of current inactivated FMD vaccines in the market, which could be used to monitor and evaluate the quality of the vaccine. FMD vaccines in the market had high 146S content and good vaccine quality.

size-exclusion high-performance liquid chromatography; inactivated foot-and-mouth disease vaccine; 146S; quality of the vaccine

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.20.019

2019-01-28；

2019-05-08

國家重點研發計劃資助（2018YFC1200501），國家重點研發計劃資助（2016YFD0501500）

朱元源，E-mail：zhuyuanyzz@163.com。

趙啟祖，E-mail：zhaoqizu@163.com

（責任編輯 林鑒非）