吉西他濱聯合厄洛替尼通過抑制突變型p53蛋白表達促進胰腺癌細胞凋亡*

黃欣昊， 柳千帆， 宋春灼， 朱海濤

(1.貴州醫科大學 臨床醫學院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學附院 臨床研究中心,貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學附院 肝膽外科， 貴州 貴陽 550004)

胰腺癌是一種化學治療效果差、對絕大多數化療藥物都不敏感的難治性惡性腫瘤[1-3]。與近年來大多數腫瘤生存率穩定增長趨勢相反，胰腺癌患者的死亡率逐年增加，且晚期胰腺癌患者5年生存率僅達3%[4-5]。1996年，吉西他濱(gemcitabine，GEM)被美國食品藥品監督管理局批準用于胰腺癌治療[6]，至今依然是胰腺癌治療的一線化學治療藥，但對患者的生存期及總生存率并沒有明顯的提高[7-8]；厄洛替尼(erlotinb，ERL)是目前臨床上唯一與GEM聯用后對患者有生存優勢的分子靶向藥物[9-11]。本課題前期研究結果表明，GEM聯合ERL可以改善患人胰腺癌腫瘤裸鼠的生存狀態，并延長其中位生存期[12]。為進一步探究GEM與ERL合用治療胰腺癌的分子機制，本研究通過雙染流式細胞技術觀察不同藥物處理后人胰腺癌細胞PANC-1細胞的凋亡情況，運用實時熒光定量PCR法觀察p53基因的表達，同時通過Western Blot法觀察p53及其信號通路下游重要生物分子BAX蛋白表達水平，以探究GEM聯合ERL治療胰腺癌可能的生物分子機制，為臨床用藥及新藥研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株、主要藥品和試劑 人胰腺癌細胞PANC-1由中國科學院干細胞庫提供，GEM、ERL購自美國Selleck Chemicals公司，DMEM高糖培養基、含0.02%EDTA的0.25%胰酶溶液購自美國GIBCO公司，胎牛血清購自以色列Biological Industries公司，SDS、TEMED、Tris-Base、甘油、甘氨酸、Tween-20、RIPA、PMSF蛋白酶抑制劑均購自北京索萊寶公司，兔抗人抗體p53蛋白、BAX抗體購自武漢三鷹公司，二抗(羊抗兔)購自艾菲公司，一抗稀釋液購自碧云天公司，ECL發光液購自美國Millipore公司，Marker購自美國Therom公司，PVDF蛋白雜交膜購自美國Millipore公司，Annexin-V APC/7AAD流式凋亡試劑盒購自中國聯科公司，TRIzol購自美國BD公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇購自上海生工生物工程有限公司，逆轉錄試劑盒及實時熒光PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。p53、GAPDH引物購自南京金斯瑞生物技術公司(p53:上游引物：CAGCACATGACGGAGGTTGT，下游引物：TCATCCAAATA CTCCACACGC；GAPDH上游引物：ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG，下游引物：GCCATCACGCCACAGTTTC)。

1.1.2主要儀器 Optima XPN-80超高速離心機購自美國BECKMAN公司，371型細胞培養箱購自美國Thermo公司，AB2-4S1型生物安全柜購自新加坡藝思高科技公司，Mini-Pharma型垂直電泳儀購自美國Bio-Rad公司，3300型成像系統的影像分析器購自中國勤翔公司，CFX96型實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司，NanoDrop 2000核酸定量儀購自美國Thermo公司，Navios三激光10色流式細胞分析儀購自美國BECKMAN公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及藥物干預分組 PANC-1細胞培養條件是在25 cm2斜頸濾膜透氣培養瓶中加入4～5 mL含10%滅活胎牛血清的DMEM高糖完全培養基，5%的 37 ℃ CO2培養箱中培養；細胞呈單層貼壁生長，細胞生長至80%～90%時用0.25%含EDTA胰酶消化傳代；取生長良好的對數生長期PANC-1細胞分別在無任何藥物完全培養基(對照組)、含12 nmol/L ERL完全培養基(ERL組)、含80 nmol/L GEM完全培養基(GEM組)及含20 nmol/L ERL和4 nmol/L GEM完全培養基(ERL聯合GEM組)中培養24 h。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡 將1.3.1項下各組培養24 h后的PANC-1細胞用預冷PBS洗滌、胰酶消化后，收集1 × 105個細胞至離心管中。用Annexin V-APC/7AAD細胞凋亡法處理收集到的細胞，取500 μL染色緩沖液(Binding Buffer )重懸細胞，每管加入Annexin V-APC 5 μL和7-AAD 10 μL，室溫避光孵育細胞5 min，將染好的細胞放入Navios三激光10色流式細胞分析儀中檢測凋亡細胞數，比較各組細胞凋亡率。

1.2.3實時熒光定量PCR法檢測p53基因表達 將1.2.1項下各組培養24 h后的PANC-1細胞用PBS溶液清洗3次，采用Trizol法提取樣品中總RNA，并使用NanoDrop 2000核酸定量儀檢測并鑒定總RNA濃度及純度。通過逆轉錄試劑盒將提取的RNA進行逆轉錄反應，使用實時熒光定量PCR試劑盒檢測p53，反應體系按照解鏈(95 ℃、30 s)，退火延伸(95 ℃、5 s，60 ℃、30 s)，共40個循環。根據儀器檢測得到的循環閾值(Cycle threshold，CT值)，通過相對定量2-ΔΔCt法計算得到基因的相對表達量。

1.2.4Western blot蛋白印跡法檢測p53、BAX蛋白表達 將“1.2.1”中各組培養24 h后的PANC-1細胞收集至1.5 mL離心管中，PBS溶液清洗，以2 000 r/min離心10 min后去除廢液，重復3次。冰上加入含PMSF的RIPA蛋白裂解液200 mL混懸細胞，冰上裂解30 min后，以4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液并加入5×聚丙烯酰氨凝膠電泳上樣緩沖液(SDS-PAGE Loading Buffer)，金屬浴100 ℃加熱5～10 min，立即放置于冰中保存于-80 ℃冰箱。Western blot 蛋白印跡系樣品在10% 的SDS聚丙烯酰胺凝膠中，80 V恒壓電泳30 min后電壓上調至120 V，恒壓電泳約60 min；用0.45 μm PVDF膜、250 mA恒流濕轉90 min，5%脫脂牛奶室溫封閉30 min后，將PVDF膜放入稀釋好的p53一抗孵育液、BAX一抗孵育液及GAPDH一抗孵育液中，4 ℃恒溫孵育過夜；室溫中孵育二抗60 min后用TBST室溫振蕩洗膜，滴加ECL化學發光液后于化學發光儀中曝光并觀察結果，通過Image J軟件進行圖像分析蛋白表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 PANC-1細胞凋亡

聯合組PANC-1細胞的凋亡率分別高于對照組、GEM組和ERL組細胞(P<0.05或P<0.01)，但其余各組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：A為對照組，B為ERL組，C為GEM組 ，D為聯合組，E為各組細胞凋亡率；與聯合組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001。

2.2 PANC-1細胞中p53基因表達

與對照組比較，GEM組、ERL組和聯合組PANC-1細胞中p53基因的表達量均明顯下降(P<0.001)。見圖2。

注：與對照組比較，(1)P<0.001，(2)P<0.0001。

2.3 PANC-1細胞中p53蛋白和BAX蛋白表達

聯合組PANC-1細胞中p53蛋白表達量分別低于對照組、GEM組和ERL組(P<0.05或P<0.01)，其余各組比較差異均無統計學意義(P>0.05)；聯合組PANC-1細胞中BAX蛋白表達量分別高于對照組、GEM組和ERL組(P<0.05或P<0.01)，其余各組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖3、圖4。

3 討論

胰腺癌患者死亡率高，生存期短，中位生存期介于4～6月[13]，且大多數對胃腸道癌癥起效的化療方案對胰腺癌并沒有很好的應答[3,14]。目前在胰腺癌的治療中，GEM作為胰腺癌治療的一線用藥廣泛應用于臨床中[6]。由于腫瘤的異質性，單獨使用GEM易導致胰腺癌患者產生耐藥性[6,15]。與此同時，多數GEM的聯合化療方案雖然在II期研究中發現很有前景，但在隨后的臨床人群隨機實驗中并未對患者總體生存期有明確的改善，例如GEM-氟尿嘧啶、GEM-伊立替康、GEM-順鉑和GEM-奧沙利鉑等，即聯合用藥似乎與單獨使用GEM的存活時間相同或優勢不明顯[15]。因此對于那些已經接受了以GEM為基礎的一線治療，但治療后效果不佳或僅取得部分進展，同時愿意且能進行進一步化療的胰腺癌患者，目前沒有更優的治療選擇[3,7,14]。

注：與聯合組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01。

注：與對照組比較， (1)P<0.05,(2)P<0.01。

ERL是首個與GEM聯用后患者生存期出現優勢的分子靶向藥物[9-11]。ERL是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，靶向抑制表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR )。研究表明，大部分的胰腺癌患者中EGFR表達都有明顯上調，并且與預后不良和疾病進展相關[16-17]；阻斷EGFR酪氨酸激酶信號傳導會降低人胰腺腫瘤異種移植物的生長和轉移，并改善GEM的抗癌作用[18-19]；ERL的抗腫瘤性與抑制EGFR的表達有著密切聯系[9]。但大部分研究的檢測結果發現，突變型EGFR在胰腺癌中很罕見[11]；有無突變EGFR患者之間的存活時間沒有顯著差異[11]。由于大多數胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)患者攜帶有EGFR下游的鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)突變[2, 11]。研究表明KRAS的突變會降低ERL對腫瘤的治療效果[11]。因此很難解釋為什么上游EGFR抑制對PDAC患者有益[15]。研究顯示，KRAS突變與p53突變常共存于胰腺癌中，且兩者之間可能存在著一定的聯系[20]。p53基因是一種抑癌基因，突變后使p53蛋白分子的空間構象發生改變形成突變型p53蛋白，突變型p53蛋白分子失去了對細胞生長、凋亡和DNA 修復的調控作用，喪失抗增殖特性，反而產生“功能增益”致癌特性，因此p53基因由抑癌基因轉變為癌基因，從而有助于腫瘤細胞增殖、存活和轉移[21-22]。腫瘤中的突變p53基因是在多種腫瘤譜系中廣泛存在的癌基因，與腫瘤的增殖和生存有著密切的聯系[23-24]。研究發現，約75%的胰腺癌中發現有p53基因突變，p53基因的突變與胰腺癌的分化有著密切關系[2,8]；突變型p53蛋白的持續表達是維持小鼠胰腺癌轉移表型的需要[25]。在p53信號通路中下游分子BAX是介導p53信號通路的凋亡作用關鍵分子，通過BAX的釋放以及BAX寡聚化并插入線粒體外膜不可逆地誘導線粒體外膜透化，從而誘導細胞凋亡[26-28]。

本實驗選用KRAS、p53均突變的人胰腺癌細胞系PANC-1細胞進行研究，通過流式細胞凋亡實驗結果顯示GEM組、ERL組及聯合組均能在體外有效地促進胰腺癌細胞PANC-1的凋亡，尤其以聯合組的凋亡程度最為明顯。這似乎表明GEM與ERL合用可以增加對胰腺癌細胞的抑制，促進細胞凋亡。與此同時，實時熒光PCR實驗和蛋白印跡實驗結果顯示，p53基因表達在ERL組、GEM組和聯合組中均呈明顯下調，GEM組、ERL組以及聯合組均可以使p53蛋白的表達水平降低以及BAX蛋白的表達水平升高，尤其是在聯合組中差異有統計學意義(P<0.05)。這些結果提示GEM聯合ERL可能通過抑制了胰腺癌細胞中的突變型p53的表達，同時誘導了p53信號通路中下游重要分子BAX的表達升高，從而起到抑制腫瘤細胞生長和促進腫瘤細胞凋亡的作用。此外，本研究結果還顯示，兩種藥物的聯合使用對人胰腺癌細胞系PANC-1細胞凋亡、p53和BAX的表達影響均明顯優于兩種藥物的單獨使用。GEM和ERL的合用在這些方面的表現優于兩種藥物單獨使用，提示兩種藥物在合用中可以增加彼此對胰腺癌細胞的抑制作用。

綜上所述，本實驗通過體外實驗結果表明，GEM聯合ERL可能通過影響p53信號通路，下調突變型p53，誘導并上調BAX的表達，從而發揮促進腫瘤的凋亡作用。然而，有關兩種藥物聯合與p53信號通路之間更準確的作用機制尚有待進一步確定，還需在其他胰腺癌細胞系中進行驗證，從而為改善胰腺癌藥物治療作用及胰腺癌患者的愈后提供理論依據。