低強度超聲輻照對人宮頸癌HeLa細胞凋亡及Casepase-12蛋白表達的影響*

秦娟， 宋國林， 王建三, 林虹， 劉卿， 陳錦云， 王嫣**

(1.貴陽市婦幼保健醫院 婦科， 貴州 貴陽 550003； 2.貴州省中醫藥大學第二附屬醫院 重癥醫學科， 貴州 貴陽 550003； 3.重慶醫科大學 生物醫學工程學院 省部共建國家重點實驗室培育基地-重慶市超聲醫學工程重點實驗室 重慶市生物醫學工程學重點實驗室， 重慶 400016)

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，傳統治療方法以手術、化療及放療為主，但患者生存率仍不理想，且這些傳統治療方法對尚未生育的育齡婦女影響較大；因此，尋求無創治療宮頸癌是目前全球的研究熱點[1-2]。目前，超聲治療被認為是目前腫瘤治療的一種無創新方法[3]，已應用于慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤樣病變，甚至宮頸癌[4]。有研究發現，相比較于正常細胞，低強度超聲更容易誘導腫瘤細胞凋亡，特別是惡性腫瘤細胞的凋亡更加明顯[5-7]。HeLa腫瘤細胞株是宮頸癌細胞中具有代表性的人宮頸癌細胞，本研究采用低強度超聲輻照對HeLa細胞進行照射、然后繼續培養，于輻照后6 h及24 h時，采用Annexin V/PI雙染法檢測HeLa細胞的凋亡率，透射電子顯微鏡觀察細胞的結構變化，Western blot測定細胞勻漿中半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-12(Casepase-12)蛋白表達水平，免疫組織化學法檢測Caspase-12蛋白在HeLa細胞中的陽性表達率，探討低強度超聲對人宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 人宮頸癌HeLa細胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司，細胞培養于含有10%胎牛血清及1%雙抗的高糖DMEM培養液中，于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養，每2～3 d傳代1次，細胞密度約為5×105時進行后續實驗。

1.1.2主要儀器 超聲輻照儀(重慶海扶公司生產，超聲功率輸出0.5～5 W/cm2，可連續輸出，頻率9～10 MHz ，內置功率調節)，細胞培養瓶及細胞培養板購自美國Costar公司，倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，CO2培養箱購自日本Sanyo公司，電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3主要試劑 高糖DMEM及胎牛血清均購自Gibco公司，CCK-8檢測試劑購自碧云天生物技術有限公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司，Anti Caspase-12和生物素標記的二抗、內參一抗、羊抗兔IgG等均購自美國Abcam公司，ECL增強化學發光檢測試劑盒購自美國PIERCE公司，2.5%戊二醛溶液、1%四氯化鋨、丙酮等均購自北京化工廠。

1.2 方法

1.2.1超聲輻照 將對數生長期的細胞懸液調整濃度為1×109/L，每管2 mL。輻照處理組：超聲探頭固定于細胞輻照儀器底部，將細胞懸液放置于細胞輻照裝置內、頻率10 MHz、0.25 W/cm2，輻照10 s。研究設立對照組(細胞進行假照，輻照時間、輻照方式同輻照處理組)。

1.2.2細胞凋亡 采用Annexin V/PI雙染法檢測，將處于對數生長期的細胞,用篩選參數超聲輻照后再置培養箱培養，于輻照后6及12 h收取細胞懸浮液,1 000 r/min離心5 min，丟棄上清液,加入1×Binding buffer 500 μL、Annexin V-FITC 5 μL及PI 10 μL,輕輕混勻，室溫、避光反應15 min，1 h內進行流式細胞儀檢測。

1.2.3細胞微結構觀察 調整細胞濃度為1×108/L，3 000 r/min離心3 min，丟棄上清液，2%戊二醛固定后進行脫水。丟棄去殘余脫水劑，室溫下依次加入丙酮-EPON812包埋劑、純包埋劑進行完全包埋，切片、干燥后用醋酸雙氧鈾染色液室溫下染色10 min，鉛染色液室溫下染色12 min，沖洗并用濾紙吸干，透射電子顯微鏡觀察細胞結構。

1.2.4細胞勻漿中Caspase-12蛋白水平 采用Western blot法檢測，細胞裂解液提取細胞總蛋白質， BCA法測定蛋白質濃度,進行SDS-PAGE分離蛋白質，將蛋白質轉移到 PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h, 在4℃冰箱中使用一抗(稀釋比例100 ∶1)孵育過夜,常溫下使用辣根過氧化物酶標記的二抗孵2 h, 加入ECL曝光后進行半定量分析。

1.2.5Caspase-12蛋白陽性表達率 采用免疫組織化學法檢測，制作細胞爬片、免疫組織化學染色前使用0.5%Triton X-100、3% H2O2處理細胞，PBS漂洗，一抗孵育(稀釋比1 ∶100)4 ℃ 過夜(陰性對照用PBS液代替一抗)，加入二抗工作液37 ℃孵育30 min(Envision 兩步法)，DAB顯色10 min(避光，鏡下觀察至棕色)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞凋亡

Annexin V/PI雙染法結果顯示：與對照組HeLa細胞凋亡率比較，輻照后6 h時HeLa細胞凋亡率(46%)明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；輻照后24 h時HeLa細胞凋亡率(80%)增加更明顯，差異有統計學意義(P<0.01)。圖1。

2.2 細胞超微形態

電鏡觀察結果顯示，與對照組(圖2A)比較，輻照后6 h時HeLa細胞染色質固縮并凝結成塊、出現凋亡小體(圖2B，白色小框)，輻照后24 h時的HeLa細胞漿濃縮、內質網變疏松并與胞膜融合，形成空泡(圖2C)。

對照組 輻照6 h 輻照24 h

2.3 細胞勻漿中Caspase-12 蛋白表達

Western blot結果顯示，與對照組比較，輻照后6 h時HeLa細胞勻漿中Caspase-12 蛋白表達水平明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；輻照后24 h時增加更明顯，差異有統計學意義(P<0.01)。圖3。

A B

2.4 HeLa細胞中Caspase-12 蛋白陽性表達率

結果顯示，Caspase-12在對照組細胞中無表達；在人宮頸癌HeLa細胞中的表達主要定位于胞漿，輻照后6及24 h時HeLa細胞中Caspase-12 呈陽性表達，可見胞漿內充滿棕黃色顆粒；與對照組比較，輻照后6時HeLa細胞中Caspase-12 呈陽性表達率顯著升高(P<0.05)；輻照后24 h更明顯，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

注：與對照組比較，(1)P<0.05, (2)P<0.01。

3 討論

超聲波是一種非電離能量，由于超聲對生物組織細胞特有的理化作用，其研究前景廣闊。研究表明，超聲可通過多種起始途徑及信號傳導系統誘導多種組織細胞凋亡。超聲治療已成為當今抗腫瘤的研究熱點。腫瘤細胞、病變組織、細胞較正常細胞對超聲更為敏感[8-11]。而近年來的研究發現誘導細胞凋亡是超聲治療腫瘤的重要生物學機制之一，其應用之一是采用低劑量超聲[12]。有研究報告低能量超聲可以誘導腫瘤細胞凋亡[13-15]。且研究表明低能量超聲對不同腫瘤細胞的凋亡誘導時間與劑量有差別[16]。

誘導細胞凋亡是腫瘤治療的機制之一。細胞發生凋亡時，細胞膜出現膜外翻現象，細胞皺縮，核固縮及染色質凝集，核碎裂、凋亡小體形成等?，F大多采用流氏細胞術及投射電鏡檢測細胞凋亡[13,16]。已有研究發現，不同頻率、強度超聲導致細胞對其有應答反應，可能與細胞信號的調控及傳導有關。而低強度超聲在誘導細胞凋亡、細胞通透性增加、細胞結果改變方面研究也逐漸引起重視。已證實低頻低強度超聲會因對細胞的空化效應，導致細胞骨架、細胞膜表面形態、甚至染色體改變，從而選擇性殺傷腫瘤細胞[17]。本研究結果顯示，低強度超聲可誘導宮頸癌細胞發生凋亡，在超聲輻照6 h，流式細胞術檢測到凋亡率為46%，投射電鏡可見凋亡小體。并且隨著時間延長，凋亡發生率達到80%(24 h)。臨床研究表明CINⅠ級患者經聚焦超聲治療后3個月,宮頸局部組織中P16 和Ki-67的表達都降低，推測可能與凋亡有關[18]。本研究結果提示低強度聚焦超聲介導細胞凋亡，并且隨著時間延長，導致細胞死亡。

Caspase 家族是細胞發生凋亡的常見通路，而既往研究明確的是Caspase-12參與執行細胞凋亡步驟中是起主要作用的分子[19]。 超聲刺激能使人宮頸癌細胞株存活率下降，既往對其機制的研究主要集中在依賴于Caspase的凋亡[20]。本研究中超聲處理后用免疫組織化學和Western blot法檢測凋亡相關蛋白Caspase-12 表達，結果發現，Caspase-12 表達隨時間延長呈增加趨勢，提示Caspase-12介導的凋亡信號可能參與了低強度超聲輻照過程。這些結果暗示Caspase-12 被低強度超聲輻照激活。然而，低強度超聲輻照激活Caspase-12的具體機制尚不清楚。

超聲對細胞的超聲——生物學效應包括熱效應和非熱效應。非熱效應包括聲機械效應效應，超聲空化、聲化學效應[21-22]。既往研究已證實改變低強度超聲的各種物理參數(頻率、時間及強度)會影響受輻射細胞的結果，不同的超聲輻照參數下對于不同的腫瘤細胞，發生的效應不同[23-24]。有學者認為低能量超聲誘導腫瘤細胞凋亡發生的機制可能與空化效應和機械效應有關[3,11]。本研究采用低強度超聲對細胞產生非熱生物學效應誘導細胞凋亡，與既往研究一致。但低強度超聲波作用的相關分子信號和關鍵蛋白質，誘導細胞凋亡的生理生化機制的仍然是難以捉摸的。考慮超聲作為外界刺激，可能與低強度超聲輻照激活宮頸癌細胞產生應激反應有關,繼而啟動細胞凋亡機制。目前還不清楚超聲誘導細胞凋亡的具體途徑。有研究報道，低強度超聲誘導的細胞凋亡通路被認為是與線粒體途徑有關[25]。因此，課題組下一步工作將考慮研究低強度超聲誘導宮頸癌細胞凋亡的相關途徑。

綜上，本研究發現低強度超聲輻照可以誘導人宮頸癌HeLa細胞細胞凋亡，并通過激活Caspase-12 表達增加，促進宮頸癌細胞凋亡。但對于超聲誘導的宮頸癌細胞凋亡的深入分子機制，還需要進一步的分析，闡明低強度超聲反應影響的分子信號通路。