婦科再造丸含藥血清對人子宮肌瘤細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響*

胡穎， 羅俊， 張晴， 葉蘭， 胡曉燕， 鄭濤

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 藥理學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院 機能學實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫科大學附院， 貴州 貴陽 550025； 4.貴州中醫藥大學第一附屬醫院， 貴州 貴陽 550001)

子宮肌瘤起源于子宮平滑肌細胞，多見于30～50歲女性，發病率高達20%～25%，是女性生殖器中最常見的良性腫瘤，也是未絕經婦女行子宮全切術的最主要原因，嚴重威脅著女性的身心健康[1-3]。目前多采用激素類藥物治療子宮肌瘤，但副作用大，停藥后易復發，治療效果并不理想[4～6]，因此臨床上采用中藥輔助治療子宮肌瘤，取得了較滿意的療效[7-8]。婦科再造丸(Fu Ke Zai Zao pill，FKW)系貴州名醫王聘賢所創，至今已有70多年的歷史，具有活血化瘀、行氣止痛、益氣健脾之功效，臨床廣泛用于月經不調、痛經、體虛帶下和婦科炎癥等婦科疾病，對子宮肌瘤癥狀亦具有緩解作用。本課題組前期研究顯示FKW對于雌、孕激素誘發的大鼠子宮平滑肌瘤樣增生有顯著的抑制作用，并能促進體外培養人子宮肌瘤細胞的凋亡[9-13]。有研究表明，細胞凋亡調控基因表達異常是子宮肌瘤發生、發展的重要因素之一，其中B細胞淋巴瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族起著重要的作用[14]，然而目前FKW促進子宮肌瘤細胞凋亡相關機制的研究尚未見報道。因此，本研究通過血清藥理學方法，觀察FKW對體外培養人體子宮肌瘤細胞凋亡相關蛋白Bcl-2及Bax表達的影響，探討FKW促進子宮肌瘤細胞凋亡可能的作用機制，為臨床應用增加新的適應癥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源 選擇2015年1月-2017年4月因子宮肌瘤行子宮全切或肌瘤剔除術的患者4例，35～50歲，未絕經，術前3個月無類固醇激素使用史，術后經病理學診斷為子宮肌瘤。

1.1.2實驗動物 清潔級3月齡Sprague Dawley(SD)大鼠，雌性，體質量(200±20)g，合格證號SCXK(黔)2012-0001，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.3藥物、主要試劑與儀器 FKW(棕褐色丸劑，2.6 g/10丸，貴陽德昌祥藥業有限公司生產，批號20151021)，桂枝茯苓膠囊(Gui Zhi Fu Lin capsule, GZFL，連云港康緣制藥股份有限公司生產，批號150106)；Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培養基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，二甲基亞砜和胰蛋白酶(美國Sigma公司)，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體和兔抗人Bax單克隆抗體(美國CST公司)，單克隆兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體和兔抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(英國Abcam公司)；CO2恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)，QL-901旋渦振蕩器(海門市麒麟醫用儀器廠)，Mini型蛋白電泳系統(美國Bio-rad公司)及LG2000數碼凝膠圖像分析系統(杭州朗基科學儀器有限公司)。

1.1.4標本及藥品制備 術中無菌條件下取子宮肌瘤組織1 cm3，加入3%雙抗(青、鏈霉素)的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)10 mL ，冰浴密閉盡快送入細胞培養室。FKW試驗前用蒸餾水配制成高劑量組藥液(終濃度112 g/L)，再依次稀釋配制成中、低劑量組藥液(終濃度分別為56、28 g/L)；GZFL臨用前用蒸餾水配制成濃度為30 g/L混懸液。

1.2 方法

1.2.1給藥和制備血清 取SD大鼠60只，隨機分為空白組(無藥血清組)、FKW低劑量組(28 g/L)、中劑量FKW組(56 g/L)、高劑量FKW組(112 g/L)及GZFL組，每組12只。無藥血清組大鼠每次灌服生理鹽水10 mL/kg，FKW高、中、低劑量組每次灌服相應藥液10 mL/kg(分別為成人等效劑量12.9倍、6.5倍、3.2倍)，GZFL組每次灌服混懸液10 mL/kg(為成人等效劑量6.4倍)。各組大鼠給藥2次/d，間隔6 h，連續2 d，第3天末次給藥1 h后股動脈取血，分離血清，56 ℃、30 min滅活，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后分裝，-20 ℃保存備用。

1.2.2人子宮肌瘤細胞的原代培養及鑒定[15]無菌條件下用3%雙抗PBS液漂洗肌瘤組織，眼科剪將標本剪碎為1 mm3組織塊，間距2～3 mm擺放于培養瓶中，置于37 ℃的5% CO2培養箱內，吸出培養液，翻轉培養瓶使瓶底朝上后加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，培養4 h后將培養瓶翻正培養，每2～3天換液1次，約3～4周出現致密細胞層后取出組織塊，繼續培養、傳代，傳代細胞均經α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-actin)免疫細胞化學法鑒定證實。

1.2.3Western Blot檢測人子宮肌瘤細胞中Bax、Bcl-2的蛋白表達 實驗分為無藥血清組(加入20%無藥血清)、FKW低、中、高劑量組及GZFL組(加入20%含藥血清)。收集經藥物干預72 h的各組子宮肌瘤細胞，PBS洗滌2次，裂解液冰上常規裂解30 min，12 000 r/min離心20 min，加入蛋白質上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，行SDS-PAGE電泳。電轉法將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，常溫下浸于5%脫脂牛奶，水平搖床上封閉2 h后加入一抗(鼠抗人Bcl-2單克隆抗體1 ∶1 000，兔抗人Bax單克隆抗體1 ∶1 000，單克隆兔抗GAPDH抗體1 ∶1 000)，4 ℃搖床上孵育過夜，含吐溫-20 ℃的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBST)洗滌PVDF膜5 min×6次，加入1 ∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育2 h，PBST洗膜5 min×6次，用ECL顯色試劑盒顯色，PVDF膜放入Bio-Rad圖像攝取系統，保存圖像。用LG2000數碼凝膠圖像分析系統進行條帶光密度分析，計算目的蛋白吸光度與GAPDH吸光度的比值，作為目的蛋白的相對表達水平。每個樣本重復測量3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 人子宮肌瘤細胞原代培養及鑒定

人子宮肌瘤細胞培養至第7～10天組織塊邊緣開始有細胞游出，隨著時間延長細胞逐漸分裂，最終融合成片；胞體細長，為梭形或不規則三角形，呈放射狀或旋渦狀生長，當細胞生長接近鋪滿瓶底80%時傳代，傳代周期約3～5 d，傳至3～5代的細胞形態均一，生長良好，經α-actin單克隆抗體免疫細胞化學染色證實，陽性細胞數接近100%，說明培養的肌瘤細胞純度較高，符合要求，可用于后續的實驗觀察。見圖1。

注：箭頭處為肌瘤細胞(棕黃色)

2.2 子宮肌瘤細胞Bax、Bcl-2蛋白表達

實驗結果顯示，與無藥血清組比較，FKW含藥血清各劑量組均能增加Bax蛋白相對表達量，降低Bcl-2蛋白相對表達量(P<0.05或P<0.01)，且作用隨劑量的增加有增強的趨勢(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

注：與無藥血清組比較,(1)P<0.01，(2)P<0.05；與FKW低劑量組比較,(3)P<0.01，(4)P<0.05；與FKW中劑量組比較，(5)P<0.01，(6)P<0.05。

3 討論

腫瘤是細胞增殖和死亡均發生了異常的疾病[16]。實體腫瘤細胞的死亡主要有壞死和凋亡兩種形式，一般認為，細胞凋亡抑制在腫瘤發生和發展過程中比細胞過度增殖起的作用更為重要[17]。細胞凋亡是有核細胞在凋亡基因調控下發生的細胞自我消亡的過程，是一種主動的、固有的程序化現象[18]。細胞凋亡一旦受到抑制，這部分通過“非法途徑”得以存活的細胞將持續異常“發展”，進而形成局在型腫物[19]。研究表明，Bcl-2基因家族在細胞凋亡的基因調控網絡中起著關鍵作用[20]。Bcl-2家族成員含有1～4個同源結構域，現已至少發現19個同源物，根據蛋白在細胞凋亡中的功能可將Bcl-2家族分為兩類：一類是抗凋亡的，如Bcl-2、Bcl-xl、Ced-9、Mcl-1等，另一類是促凋亡的，如Bax、Bcl-xs、Bak、Bad等[21]。其中，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最具代表性的功能相互對立的凋亡調控基因[22]。Bcl-2來源于B細胞淋巴瘤，被發現于B 細胞濾泡性淋巴瘤染色體斷裂點，是凋亡抑制基因，在細胞中高表達時可對抗細胞凋亡、延長細胞壽命，故亦被稱為“長壽基因”；Bcl-2蛋白是一種膜蛋白，位于線粒體膜，滑面內質網膜及核膜上，可通過抗氧化通路、影響Ca2+內流等多種機制抑制細胞凋亡[23]。Bax與Bcl-2有21%的同源性，主要的生物學功能是加速細胞凋亡，具有抑制腫瘤作用，Bax編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成二聚體來發揮作用[24]。二者結合可形成Bcl-2/Bcl-2、Bcl-2/Bax和Bax/Bax 三種二聚體形式，其中同二聚體Bax/Bax促進細胞凋亡，Bcl-2/Bcl-2則抑制細胞凋亡，當二者形成異二聚體Bcl-2/Bax時，Bax與Bcl-2就會相互對抗、彼此制約，因此二者對細胞凋亡形成正負調控，各自在細胞內所占的比例是調節細胞凋亡的重要因素[25]。子宮肌瘤的發病機制與細胞凋亡關系密切[14]。研究發現，Bcl-2蛋白在子宮肌瘤標本中強陽性表達，在正常子宮肌層中弱陽性表達；Bax蛋白在正常子宮肌層中強陽性表達，在子宮肌瘤標本弱陽性表達，Bcl-2/Bax在子宮肌瘤組織中的表達顯著高于正常[26-27]。因此，Bax表達水平過低、Bcl-2表達水平過高是子宮肌瘤發生發展的分子基礎。

本研究成功建立人子宮肌瘤細胞原代培養并傳代，可用于后續的實驗觀察，結果顯示FKW含藥血清各劑量組作用72 h后，子宮肌瘤細胞Bax蛋白相對表達量增加，Bcl-2蛋白相對表達量降低，與無藥血清組比較差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，且作用隨劑量的增加有增強的趨勢(P<0.05或P<0.01)，提示FKW促進子宮肌瘤細胞凋亡的作用與Bcl-2家族密切相關，即FKW可上調Bcl-2家族中抗凋亡成員Bcl-2的表達并降低促凋亡成員Bax的表達，從而Bax/Bax結合的同二聚體減少，Bcl-2/Bax結合的異二聚體相對增多，進而對子宮肌瘤細胞凋亡實現正調控。FKW是否還具有Bcl-2家族外的調控機制促進子宮肌瘤細胞凋亡，還有待進一步深入研究。此外，由于FKW由42味中藥組成，組方及作用機制復雜，藥理活性的發揮可能是源于FKW組方中特有的成分，也可能是各組分相互作用后的產物，或者是其在體內復雜的藥物代謝過程中所產生的代謝物質，其具體發揮效應的成分亦有待進行進一步深入研究。

綜上所述，FKW可通過影響細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達，促進子宮肌瘤細胞凋亡，抑制肌瘤生長。