HGF上調SnoN mRNA抑制高糖介導大鼠腎小管上皮細胞纖維病變機制*

王圓圓， 劉慧銘， 梁露群， 張會芳， 向珈誼， 郭兵

(貴州醫科大學 基礎醫學院 病理生理教研室， 貴州 貴陽 550025； 貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

轉化生長因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smads信號通路介導的腎小管間質纖維化病變是糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)的重要發病機制[1]，本課題前期研究發現，轉錄共抑制因子(ski-related novel protein N，SnoN)作為TGF-β1/Smads信號通路的負調節因子，在 DN發生發展過程中蛋白表達顯著下調，且隨病程進展遞減[2-3]。有研究表明，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)作為一種內源性腎臟保護因子，能有效抗纖維化，在不同類型腎臟細胞中可通過不同的機制抑制TGF-β1/Smads通路效應，從而延緩或減輕慢性腎臟纖維化的發生發展[4]；也有研究表明，無論是HGF單一刺激或是與TGF-β1共同處理人腎小管上皮細胞，均能上調SnoN的蛋白表達，提示HGF可通過活化細胞外信號調節激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase-1 and -2，ERK1/2)上調SnoN在基因水平的表達[5-6]。因此，本研究通過觀察外源性HGF對高糖條件下的大鼠腎小管上皮細胞纖維化病變、SnoN表達及ERK1/2活化的影響，探討HGF抗纖維化的作用靶點及可能機制，為治療DN提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要材料與試劑

大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E由上海復旦大學陸利民教授惠贈，人重組HGF(human recombinant HGF，rhHGF)購自美國Sigma公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國Gibco Introvagen公司，低糖DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培養液購自美國Hyclone公司，Mouse-anti-α-平滑肌肌動蛋白(α-sooth muscle actin, α-SMA)、Rabbit-anti-膠原蛋白Ⅲ(CollagenⅢ,Col-Ⅲ)、Rabbit-anti-ERK1/2(bs-2637R)、Rabbit-anti-Phospho-ERK1/2(Thr202/Tyr204)(p-ERK1/2)多克隆抗體購自中國博奧森生物技術有限公司，Mouse-anti-β-actin單克隆抗體和DAB顯色劑購自中國博士德生物技術有限公司，Rabbit-anti-SnoN(sc-9141)和Rabbit-anti-鈣黏蛋白(E-cadherin)購自美國Santa Cruz公司。生物素標記羊抗兔IgG(BA1003) 、生物素標記羊抗小鼠IgG(BA1001)]和兩步法免疫組化檢測試劑購自中國中杉金橋生物技術有限公司，Western印跡用PVDF(polyvinylidene fluoride)膜和3MMWhatman濾紙購自美國Millipor公司，Goat-anti-Rabbit FITC、Goat-anti-Mouse Tex-red及4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI)和超敏ECL(electrochemiluminescence)化學發光試劑盒購自中國碧云天生物研究所，總RNA提取試劑盒(TRIzol法)購自中國天根生化科技有限公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Fermentas公司， iQTMSYBR? Green Supermix購自美國Bio-rad公司。OLYMPUS-DP72倒置熒光顯微鏡購自美國OLYMPUS公司，其它試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1主要溶液的配置 rhHGF母液為用無菌去離子水配置凍干粉使其濃度為10 mg/L，混勻標記好日期和濃度，-20 ℃儲存。2% FBS正常糖培養液(5.5 mmol/L glucose)為低糖DMEM培養基245 mL和滅活FBS 5 mL混入無菌鹽水瓶中即得；2% FBS高糖培養液(5.5 mmol/L glucose加入19.5 mmol/LD-glucose)系19.5 mmol/LD-glucose 0.878 3 g，溶于245 mL低糖DMEM培養基，用0.22 μm濾器過濾除菌后，加入滅活FBS 5 mL混入無菌鹽水瓶中即得；rhHGF高糖細胞培養液為分別取復溫融化的rhHGF母液50、100 μL于50 mL高糖培養液配置終濃度為10、20 μg/L，吹打混勻，4 ℃保存。

1.2.2細胞培養 將生長狀態良好、融合度達到80%～90%的NRK-52E細胞加入低糖DMEM，置37 ℃、5% CO2的培養箱16 h，使細胞同步化生長。將細胞分為對照組(NG組，給予正常糖培養液培養)、高糖對照組(HG組，給予高糖培養液培養)、10 μg/L rhHGF干預組(低劑量rhHGF組，給予10 μg/L rhHGF高糖培養液培養)及20 μg/L rhHGF干預組(高劑量rhHGF組，給予20 μg/L rhHGF高糖培養液培養)，每組細胞繼續培養48 h。

1.2.3免疫熒光染色 用免疫熒光間接染色法分別檢測E-cadherin(1 ∶200)、α-SMA (1 ∶100)在NRK-52細胞的表達和分布，DAPI復染細胞核，OLYMPUS-DP72倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.4Western blot檢測 各組細胞加裂解液裂解，分別提取蛋白，經電泳轉膜封閉后，目的蛋白Ⅰ抗如下：SnoN(1 ∶200)、ERK1/2(1 ∶400)、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)(1 ∶300)、E-cadherin (1 ∶200)、α-SMA(1 ∶150)、Col-Ⅲ(1 ∶200)、β-actin(1 ∶400)，檢測各目標蛋白的相對表達量。

1.2.5Real-time PCR檢測 TRIzol一步法提取各組細胞的總RNA，核酸蛋白儀測RNA的濃度和純度(A260/A280在1.8～2.1)，取1 μg腎組織總RNA按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit說明進行逆轉錄，合成cDNA，-20 ℃保存備用將反轉錄的 cDNA 進行 PCR 擴增，管家基因 β-actin做內參。SnoN上游引物 5′-CCATTCAATGCCCCATCCT-3′，下游引物 5′-AGTTCGTGGCCGCAATAAAG-3′，擴增產物大小為81 bp；β-actin上游引物 5′-GCCAACACAGTGCTGTCT-3′，下游引物 5′-AGGAGCAAT-GATCTTGATCTT-3′，擴增產物大小為 114 bp。將反轉錄成 cDNA 行熒光定量 PCR，反應條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性20 s、55 ℃退火40 s，擴增 45 個循環后收集數據，繪制動力學曲線讀取 Ct值。將各組目的基因的Ct值與管家基因的Ct值相減得△Ct，擴增重復 3 次，計算出各組mRNA表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 NRK-52E細胞形態

正常糖培養的NRK-52E細胞E-cadherin高表達，幾乎無α-SMA蛋白陽性染色；高糖培養NRK-52E細胞E-cadherin表達減少，α-SMA表達增多，見圖1。

圖1 不同環境下NRK-52E細胞的E-cadherin、α-SMA表達(免疫熒光染色，×1 000)

2.2 NRK-52E細胞E-cadherin、α-SMA及Col-Ⅲ蛋白表達

Western blotting檢測結果顯示，與NG組比較，HG組NRK-52E細胞中α-SMA和Col-Ⅲ蛋白表達上調，E-cadherin蛋白表達下調，差異均有統計學意義(P<0.05)；與HG組比較，在rhHGF干預組，10 μg/L或20 μg/L rhHGF均可使NRK-52E細胞α-SMA和Col-Ⅲ蛋白表達減少，E-cadherin蛋白表達增多，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與NG組同指標比較，P<0.05；(2)與HG組同指標比較，P<0.05；(3)與低劑量rhHGF組同指標比較，P<0.05。

2.3 NRK-52E細胞SnoN表達

Western blotting結果顯示，與NG組相較，HG組細胞中SnoN蛋白的表達減少(P<0.05)；而與HG組相較，在rhHGF干預組，10 μg/L或20 μg/L rhHGF均可使SnoN蛋白的表達增多(P<0.05)，見圖3。Real-time PCR檢測SnoNmRNA可見，與NG組相較，HG組SnoNmRNA表達增加，而與HG組相較，在rhHGF干預組, 10 μg/L或20 μg/L rhHGF均可使SnoNmRNA的表達進一步增加(P<0.05)，見圖4。

注：(1)與NG組比較，P<0.05；(2)與HG組比較，P<0.05。

注：(1)與NG組比較，P<0.05；(2)與HG組比較，P<0.05。

2.4 HGF對高糖培養下NRK-52E細胞ERK1/2活化的影響

Western blotting檢測結果顯示，與NG組相較，高糖上調NRK-52E細胞中p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)蛋白表達(P<0.05)，總ERK1/2蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與HG組相比，在rhHGF干預組, 10 μg/L或20 μg/L rhHGF均可使進一步上調p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)表達(P<0.05)，見圖5。

注：(1)與NG組比較，P<0.05；(2)與HG組比較，P<0.05。

3 討論

近年的研究發現，HGF具有延緩DN病變的作用，HGF對腎組織多種細胞表現出保護作用[4]。HGF受體在腎臟表達相當廣泛，是c-met原癌基因編碼的一種跨膜酪氨酸激酶[5]。HGF作為一種多效性的生長因子，與受體結合引起酪氨酸激酶活化，激活細胞內多個信號級聯反應[7-9]。在體和離體的高糖誘導腎系膜細胞發生的氧化應激，及TGF-β1介導的Fn、Col-3的合成，均可被外源性HGF抑制[10-12]； HGF具有抑制腎小管上皮細胞在腎臟疾病中發生的炎癥、纖維化病變及間質損傷的作用[12-15]，增加HGF可抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡[16]；研究發現，給予血管緊張素-2誘導腎臟病變的HGF轉基因小鼠在纖維化進程中仍表現出介導腎組織肌成纖維細胞凋亡的作用，發揮抗纖維化特性[17]。HGF阻斷或抑制腎臟的纖維化病變，主要是由于HGF與TGF-β1信號通路之間的“crosstalk”架聯[18]。TGF-β1與細胞膜上受體結合后，磷酸化胞內Smad2/3蛋白與Smad4結合并核移位，將細胞信號轉導到細胞核，誘導目的基因的活化和轉錄[1,19]。系膜細胞HGF不影響TGF-β1介導Smad2蛋白的磷酸化，但是能快速地上調Smad轉錄共抑制因子(TG-interacting factor，TGIF)，增多的TGIF顯著抑制依賴TGF-β1/Smad信號通路的靶基因啟動子的活化，并且完全抑制了TGF-β1介導的α-SMA表達[6]。在人腎小管上皮細胞和腎臟纖維化梗阻性腎病動物實驗，HGF不影響TGF-β1誘導的Smad2的磷酸化和核轉位，而是誘導Smad轉錄抑制物SnoN蛋白的表達，如果阻斷細胞外信號調節激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase-1 and -2，ERK1/2)ERK1/2信號通路的轉導，HGF上調SnoN表達的效應將被中斷[5-6]。

本研究發現，與NG組相較，HG組NRK-52E細胞中α-SMA和Col-Ⅲ蛋白表達上調，E-cadherin蛋白表達下調，差異均有統計學意義；與高糖組比較，10 μg/L或20 μg/L rhHGF與高糖聯合處理均可介導E-cadherin表達上調，α-SMA表達下調，Col-Ⅲ合成減少，差異具有統計學意義，提示HGF抑制腎小管上皮細胞向間質細胞轉分化過程及Col-Ⅲ合成增多，具有對抗致纖維化效應。與正常糖環境相比，高糖可以激活腎小管上皮細胞 ERK1/2信號通路，差異具有統計學意義；加入10 μg/L或20 μg/L rhHGF后該通路進一步活化加強，差異具有統計學意義，提示HGF可激活胞內信號的轉導。本研究進一步檢測了SnoN蛋白和mRNA的表達，高糖環境下NRK-52E細胞中SnoN蛋白的表達減少，但mRNA表達上調，差異均有統計學意義；予以10 μg/L或20 μg/L rhHGF干預后，與單純高糖條件刺激，腎小管上皮細胞SnoN蛋白表達增多，mRNA表達上調進一步增多，差異均有統計學意義。提示在高糖狀態下，加入外源性HGF可以通過活化ERK1/2信號通路進一步上調SnoN在轉錄水平的表達，進而增加其蛋白表達，呈現出負反饋抑制調節TGF-β1/Smads通路的效應。這與Tan等[6]的研究結果相似。但本課題組前期體內和體外研究表明，高糖環境下腎小管上皮細胞HGF蛋白和mRNA都呈現出先增多后減少的趨勢，活化的ERK1/2隨高糖刺激時間的延長呈現出持續高表達的現象[20]。ERK1/2在腎纖維化發病過程中，既可被HGF激活也可被其他細胞因子激活參與腎小管上皮細胞EMT過程[21-25]。因此，在DN發病過程中活化的ERK1/2是被HGF激活還是TGF-β1激活，以及是發揮抗纖維化效應還是促纖維化效應都有待進一步研究。

綜上所述，HGF在DN過程中能阻斷或對抗高糖介導腎小管上皮細胞向間質細胞轉分化過程和間質細胞外基質沉積，并且HGF抗纖維化效應是通過活化上調SnoNmRNA表達，抑制TGF-β1/Smads信號通路起作用。