miR-34a、PD-1、PD-L1在膀胱癌中的表達及其與預后的相關性分析

景 瓊，吳金平，王光亞

(慶陽市人民醫院 a.泌尿外科，b.血液科，甘肅 慶陽 745000)

膀胱癌是我國發病率和死亡率較高的泌尿系統惡性腫瘤，多見于男性群體，具有惡化程度高、早期確診率較低、預后差、易出現遠處轉移和復發等特點[1]。目前，雖然關于膀胱癌預后相關標志物和危險因素的研究較多[2]，但臨床上仍以Sylvester等[3]于2006年提出的膀胱腫瘤危險因素評分表格作為預后的判斷標準。該方法在群組水平預測腫瘤復發及進展的準確性較高，但對于相同群組患者仍缺乏個體化、特異性的預測指標。近年來，細胞免疫學治療越來越被臨床接受，尤其是程序性細胞死亡受體-1(programmed cell death receptor-1，PD-1)/程序性細胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)通路與免疫逃逸機制關系的研究逐漸成為腫瘤免疫學領域的熱點[4]。PD-1/PD-L1是免疫反應中極其重要的協同共刺激分子，在腫瘤免疫逃逸中發揮重要作用。因此，眾多學者認為PD-1/PD-L1通路是逆轉腫瘤細胞免疫逃逸和恢復抗癌免疫應答治療的重要靶點[5-7]。與其他很多信號通路相同，PD-1/PD-L1通路也受表觀遺傳調控，而微RNAs(microRNAs，miRNAs)是表觀遺傳調控的重要分子，在很多疾病中具有早期診斷和預后評估的潛力[8]。研究發現，miR-34a在急性髓細胞白血病患者骨髓標本中呈低表達，而PD-L1呈高表達，推測兩者可能具有靶向調控關系[9]。本研究主要通過檢測miR-34a、PD-1、PD-L1在膀胱癌組織中的表達及其與預后的相關性，為篩選復發高?；颊咛峁撛诘念A測分子。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年7月至2014年6月慶陽市人民醫院泌尿外科收治的86例膀胱癌患者的存檔病理蠟塊作為研究對象，患者均經病理科主任醫師復檢確定。其中，男59例、女27例，年齡18～82歲，平均(60.18±13.64)歲。納入標準：①行膀胱癌切除術且切緣未見癌細胞浸潤；②術前未行放療、化療及其他輔助治療者；③有完整的臨床病理及術后隨訪資料。排除標準：①行姑息性切除術者；②合并其他惡性腫瘤、心腦血管疾病、免疫系統疾病、急慢性感染者；③長期服用免疫抑制劑或免疫增強劑者。本研究經慶陽市人民醫院倫理委員會批準，患者或家屬均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1切片制作 自慶陽市人民醫院病理科調取符合上述納入和排除標準患者的膀胱組織病理蠟塊，采用冰凍切片機(德國Leica公司，CM1950型)進行組織切片(約4 μm)。

1.2.2RNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測miR-34a 采用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司，批號：15596-026)提取組織總RNA。采用SuperScript RT Kit(日本TAKARA公司，批號：RR047A)逆轉錄成互補DNA。利用SYBR Green PCR master Mix試劑盒(日本TAKARA公司，批號：RR420A)進行實時熒光定量聚合酶鏈反應。miR-34a引物序列設計如下：上游引物，5′-GCAGATCTGGGGTGATTCATCG-3′；下游引物，5′-GCATCGATGTGCATGCTTGT-3′。冰浴中配制20 μL 聚合酶鏈反應體系，1個循環(95 ℃預變性30 s)，36個循環(95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸10 s)，建立聚合酶鏈反應產物擴增曲線和溶解曲線。以小分子U6作為內參，讀取Ct值，以2-ΔΔCt表示miR-34a相對表達量。miR-34a的表達參照樊茹佳等[10]的方法進行分類，miR-34a≥中位值視為高表達，反之為低表達。

1.2.3免疫組織化學染色法檢測PD-1和PD-L1 將組織切片逐步進行二甲苯脫蠟和梯度酒精水化，檸檬酸緩沖液進行組織抗原修復，冷卻后滴加過氧化氫消除內源性過氧化物酶的活性；隨后滴加PD-1一抗(1∶200稀釋，美國Abcam公司)或PD-L1一抗(1∶50稀釋，美國Abcam公司)和二抗(北京中杉金橋生物科技有限公司)。二氨基聯苯胺(二氨基聯苯胺試劑盒，日本Takara公司)染色，脫水，中性樹膠封片。免疫組織化學結果判定參照張宋安等[11]的標準，將染色后的病理切片置于400倍視鏡下，PD-1和PD-L1定位于胞膜上，隨機選擇10個視野，觀察細胞陽性表達情況，計算出被染色陽性細胞的百分比。陽性率為0(0分)，陽性率≤25%(1分)，陽性率為26%～50%(2分)，陽性率為51%～75%(3分)，陽性率>75%(4分)。同時觀察細胞染色強度：陰性(0分)，弱染色(1分)，中度染色(2分)，強染色(3分)。染色指數=陽性細胞率×染色強度，根據總分數將切片分為1～4級：0～1分(1級)，2～3分(2級)，4～6分(3級)，7～12分(4級)。其中，1級和2級為陰性表達，2級和3級為陽性表達。

1.3隨訪 建議患者術后1～3個月，每個月復查1次；4～12個月，每3個月復查1次；13～41個月，每6個月復查1次。本研究的主要研究終點為無進展生存時間，即自手術之日起至第1次出現局部復發、遠處轉移、死亡或隨訪終止的時間。

2 結 果

2.1膀胱癌組織中miR-34a、PD-1和PD-L1的表達情況 經實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測，膀胱癌組織中miR-34a的表達量為1.34±0.37，中位值為1.201，其中43例患者的miR-34a<1.201為低表達，43例患者的miR-34a≥1.201為高表達。經免疫組織化學法檢測，有55例(63.95%)膀胱癌患者腫瘤組織中的PD-1呈陽性表達，45例(52.33%)膀胱癌患者腫瘤組織中的PD-L1呈陽性表達。見圖1和2。

1a：陰性表達；1b：陽性表達；PD-1：程序性細胞死亡受體1

2a：陰性表達；2b：陽性表達；PD-L1：程序性細胞死亡配體1

圖2 PD-L1在膀胱組織的表達(S-P法，400×)

2.2miR-34a、PD-1、PD-L1在膀胱癌中的表達與臨床病理特征的關系 見表1。不同年齡、腫瘤直徑、病理分級的miR-34a低表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)，TNM分期T2～T3期患者miR-34a的低表達率高于Tis～T1期患者，淋巴結轉移患者miR-34a的低表達率高于未轉移者(P<0.01)；不同年齡、腫瘤直徑的PD-1陽性表達率比較差異均無統計學意義(P>0.05)，TNM分期T2～T3期患者PD-1的陽性表達率高于Tis～T1期，高級別腫瘤患者PD-1的陽性表達率高于低級別腫瘤患者，出現淋巴結轉移患者PD-1的陽性表達率高于未轉移患者(P<0.05)；不同年齡、病理分級PD-L1陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)，腫瘤直徑≥2 cm患者 PD-L1的陽性表達率高于腫瘤直徑<2 cm患者，TNM分期T2～T3期的PD-L1陽性表達率高于Tis～T1期患者，出現淋巴結轉移者PD-L1陽性表達率高于未轉移者(P<0.05)。

表1 miR-34a、PD-1、PD-L1在膀胱癌中的表達與臨床病理特征的關系 [例(%)]

miR-34a：微RNA34a；PD-1：程序性細胞死亡受體1；PD-L1：程序性細胞死亡配體1

2.3膀胱癌組織中miR-34a的表達量與PD-1、PD-L1 的關系 經Spearman等級相關性分析，miR-34a低表達組的PD-L1陽性表達率高于miR-34a高表達組(r=-0.121，P=0.267)；但miR-34a的表達與PD-1無關(r=-0.303，P=0.005)。見表2。

表2 膀胱癌組織中miR-34a的表達量與PD-1、PD-L1的關系 (例)

miR-34a：微RNA34a；PD-1：程序性細胞死亡受體1；PD-L1：程序性細胞死亡配體1

2.4miR-34a、PD-1、PD-L1在膀胱癌組織中的表達與患者預后的關系 隨訪截止時間為2018年10月，隨訪7～41個月，平均隨訪(32.4±7.5)個月。61例患者隨訪期間未出現復發或轉移，無進展生存率為70.93%。其中，miR-34a低表達患者3年無進展生存率為55.81%(24/43)，PD-1陽性表達患者為61.82%(34/55)，PD-L1陽性表達患者為57.78%(26/45)，經Log-rank法分析，不同miR-34a、PD-1、PD-L1表達患者3年無進展生存率比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

雖然我國膀胱癌的發病率稍低于西方國家，但據流行病學統計數據顯示，近年來膀胱癌在我國尤其是男性群體中的發病率呈逐年上升趨勢[12]。膀胱癌起病隱匿，部分患者確診時可能已經發生遠處轉移，且術后轉移率和復發率較高也是手術失敗和5年生存率較低的重要原因[13]。因此，監測術后復發、轉移具有重要的臨床意義。但單純依靠腫瘤分期、病理學分級、腫瘤大小、淋巴結浸潤等對膀胱癌患者預后預測的準確性有待提高[14]。

隨著腫瘤免疫學研究的深入，免疫逃逸被認為是腫瘤發生的主要機制之一。組織局部微環境中的免疫細胞尤其是腫瘤抗原特異性T細胞在協同刺激分子的調控下活性降低或凋亡是造成腫瘤細胞免疫逃逸的主要機制[15]。其中，PD-1/PD-L1通路是調控腫瘤免疫逃逸的重要通路之一，其通過抑制腫瘤相關細胞因子(腫瘤壞死因子-α、γ干擾素、白細胞介素-2等)的分泌抑制腫瘤特異性T細胞的功能[16]。研究顯示，PD-L1在胃癌、食管癌、宮頸癌等腫瘤細胞中表達上調，是患者預后的獨立危險因素[17-18]；PD-L1表達上調，與腫瘤浸潤T淋巴細胞表面的PD-1受體結合，抑制調節性T細胞的活化和增殖，從而促使腫瘤免疫逃逸的發生[19]。另外，miR-34a 對PD-1/PD-L1信號通路具有重要的調控作用。Wang等[20]研究證實，與癌旁正常組織相比，腦膠質瘤組織中的miR-34a呈低表達，而PD-L1呈高表達，經熒光素酶報告基因實驗證實兩者具有靶向調控關系。此外，另有學者通過細胞實驗發現，上調膠質瘤細胞miR-34a的表達量可靶向抑制PD-L1的表達，進而抑制腦膠質瘤細胞的增殖，促使其凋亡[21]。但目前關于膀胱癌與PD-1/PD-L1通路關系的研究尚少，本研究結果顯示PD-1和PD-L1蛋白在膀胱癌組織中的陽性表達率分別為63.95%、52.33%，且與患者腫瘤直徑、TNM分期及淋巴結轉移密切相關，而miR-34a與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移有關，說明miR-34a和PD-1/PD-L1通路均參與膀胱癌的發生、發展和轉移過程。在本研究中，miR-34a與PD-L1表達呈負相關；但與PD-1的表達量無關，與Wang等[20]的研究結果基本一致，說明miR-34a與PD-L1存在靶向調控關系，但具體作用機制需進一步研究證實。此外本研究結果顯示，miR-34a低表達、PD-1或PD-L1蛋白陽性表達的患者3年無進展生存率相對較低，提示膀胱癌組織中miR-34a、PD-1、PD-L1表達水平可作為預測患者預后的分子標志物。miR-34a表達水平降低、PD-1 和(或)PD-L1表達水平升高預示患者預后較差，無進展生存率較低，對于這部分患者應給予術后輔助治療及密切隨訪，這對早期發現腫瘤復發和轉移、提高患者生存率具有重要意義。

miR-34a：微RNA-34a；PD-1：程序性細胞死亡受體1；PD-L1：程序性細胞死亡配體1

圖3不同miR-34a、PD-1、PD-L1表達患者的3年無進展生存曲線

綜上所述，腫瘤組織中miR-34a低表達和PD-1、PD-L1蛋白高表達與膀胱癌的發生、發展、轉移及預后密切相關，有望成為膀胱癌早期診斷、臨床病理分期分級判斷及預后評估的輔助指標，以提前篩選出復發高危人群，術后給予適當的輔助放化療，從而有助于降低復發率、延長患者生存期。