與抗結核藥物肝損傷易感性相關的基因多態性研究進展

趙德芳，董 勤

(內蒙古醫科大學附屬醫院肝膽外科，呼和浩特 010050)

結核病是一種傳染性疾病，由結核分枝桿菌感染引起。其主要影響患者肺功能，也可以引起全身多臟器疾病。結核病在全球致死原因中占第九位[1]。世界衛生組織數據顯示，2016年全球有1 040萬人新診斷為結核病，有130萬人因結核病而死亡[2]。為應對這一全球性公共衛生問題，臨床結核病的標準治療方案為多種抗結核藥(異煙肼、利福平、吡嗪酰胺等)聯合使用[3]。而抗結核藥物治療過程中出現的抗結核藥物肝損傷(anti-tuberculosis drug induced liver injury, AT-DILI)嚴重干擾了抗結核治療方案的進行。相關數據顯示，與未發生肝損害的患者相比，我國AT-DILI患者治療強化期延長的風險增加2.11倍，治療失敗風險增加9.25倍[4-6]，且抗結核藥物引起的肝損害可導致不可逆轉的肝功能衰竭[7]。因此，AT-DILI成為結核病患者廣泛關注的問題。但其發生很難預測，許多原因可導致AT-DILI，包括遺傳(遺傳變異)、生理(年齡和性別)、病理(肝臟疾病)和環境因素(膳食化合物)等。因此，對與AT-DILI相關的遺傳因素進行研究具有重要的臨床意義。現就與AT-DILI易感性相關的基因多態性研究進展予以綜述。

1 藥物性肝損傷產生的機制

藥物性肝損傷受藥物代謝特點和代謝過程的影響。藥物性肝損傷三步工作模式闡明了其發生機制[8](圖1)：①原藥(或其代謝產物)通過細胞應激、抑制線粒體功能、免疫調節等引發肝損傷，在此過程中藥物代謝酶與轉運蛋白的基因發生變異會引起藥物代謝的變化，從而增加藥物性肝損傷的風險。②第一步引起的初步肝損害通過內在途徑(細胞促凋亡蛋白的激活、應激級聯反應等)或外在途徑[被免疫反應激活、受細胞因子調節、對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)敏感]引起線粒體通透性轉換，相關免疫蛋白的基因變異可能會對藥物性肝損傷的發生風險產生影響。③線粒體通透性轉換增強會使氧化應激反應進一步增強，從而引起肝細胞凋亡或壞死。因此，與氧化應激反應相關基因的突變可能會對藥物性肝損傷的發生風險產生影響。

圖1 藥物性肝損傷的發生機制

2 AT-DILI的特定分子機制

目前，異煙肼引起的肝損傷機制較為明確[9]。其進入肝臟后，被N乙酰基轉移酶2(N-acetyltransferase 2，NAT2)乙酰化為乙酰異煙肼，也可直接水解為異煙酸和肼，其中乙酰異煙肼和異煙酸無毒，肼有毒[10]。異煙酸可直接與甘氨酸結合排出體外，而乙酰異煙肼和有毒的肼繼續被NAT2乙酰化生成乙酰煙肼[11]。乙酰煙肼可繼續被NAT2乙酰化生成無毒的二乙酰肼，也可經細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)代謝生成乙酰偶氮、烯酮、乙酰陽離子等有毒物質，這些有毒物質須經谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase，GSTs)催化，與谷胱甘肽共價結合才能排出體外[12]。因此，在異煙肼代謝過程中，NAT2、CYP450和GSTs功能的改變可能會引起AT-DILI。目前，利福平與吡嗪酰胺的具體發病機制尚未明確[13]。但研究表明，利福平和異煙肼均可引起肝細胞損害[14]。

3 基因多態性與AT-DILI易感性

與AT-DILI相關的蛋白質主要包括：①藥物代謝酶(NAT2、CYP450、羧酸酯酶1和GSTs)；②與膽汁酸、脂質和血紅素代謝物積聚有關的蛋白質[膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)、膽鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP/ABCB11)、溶質運載蛋白家族(solute carrier family,SLC)、葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-glucuronosyl transferases,UGTs)、孕烷受體(pregnane receptor，PXR)]；③與免疫應激有關的蛋白質[人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)、TNF-α、白細胞介素(interleukin，IL)6、信號轉導及轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)]；④與氧化應激相關的蛋白[GSTs、硫氧還蛋白還原酶1(thioredoxin reductase 1，TXNRD1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)1、核因子E2相關因子2-抗氧化反應元件(nuclear factor erythroid-2 related factor 2-antioxidant response element，Nrf2-ARE)]。見圖2。

CYP：細胞色素P450；CES1：羧酸酯酶1；NAT2：N乙酰基轉移酶2；GSTs：谷胱甘肽S轉移酶；CYP7A1：膽固醇7α-羥化酶；BSEP：膽鹽輸出泵；SLC：溶質運載蛋白家族；UGTs：葡萄糖苷酸轉移酶；PXR：孕烷受體；TXNRD1：硫氧還蛋白還原酶1；SODs：超氧化物歧化酶；Nrf2-ARE：核因子E2相關因子2-抗氧化反應元件；HLAs：人類白細胞抗原；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細胞介素-6；STAT3：信號轉導及轉錄激活因子3

圖2 與AT-DILI相關的蛋白

3.1藥物代謝酶與AT-DILI易感性

3.1.1Ⅰ相代謝酶 CYP450家族為AT-DILI最主要的Ⅰ相代謝酶。研究表明，CYP2B6、CYP2C19、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5與AT-DILI的發生均有密切聯系[15]。此外，羧酸酯酶1也影響AT-DILI的發生。CYP2E1基因轉錄起始點上游有兩個多態性位點(RsaI位點和PstI位點)表現出連鎖不平衡。CYP2E1基因野生型為CYP2E1*1A，相關等位基因“C1”由RsaI(+)和PstI(-)組成；突變型為CYP2E1*5，相關等位基因為“C2”，由“C1”中任意一點發生變異，即RsaI(-)或PstI(+)所得[16]。CYP2E1*6s是CYP2E1基因內含子上的一個位點，可被限制性內切酶DraI識別，其表現型有野生型TT、純合突變型AA和雜合突變型TA。此外，位于基因5′端的CYP2E1*1D/*1C也影響著基因的調控[17]。CYP2E1等位基因與AT-DILI之間的聯系已在不同的人群中進行了廣泛研究。結果表明，CYP2E1c1/c1基因型具有較高的酶活性，可增加AT-DILI的發生風險[18-19]。動物實驗也表明，在異煙肼和利福平進行聯合治療前，用CYP2E1抑制劑治療的小鼠肝損傷較輕[20]。

除CYP2E1外，還有其他幾種CYP酶基因的多態性與AT-DILI的發生有關，如CYP2B6、CYP2C19、CYP3A5、CYP3A。其中，CYP2B6(rs3745274)基因中的G516T多態性與AT-DILI的易感性有關，當發生TT純合突變時，AT-DILI發生的可能性更大[21]。快代謝型CYP2C19發生AT-DILI的風險低[22]，且存在一定的地域差異[23]。CYP3A5*3、CYP3A4*18B兩個位點突變可能升高AT-DILI的發生風險，且與均不突變相比，CYP3A5*3單一突變也可能升高AT-DILI的發生風險[23]。

羧酸酯酶1在代謝過程中發揮重要的催化作用，其承擔著內源性和外源性物質酯、硫酯、酰胺鍵的水解和酯交換反應[13]。羧酸酯酶1在肝內表達，參與異煙肼的代謝過程。Yamada等[21]發現，羧酸酯酶12基因-2位點C/G變異在英國人群中影響羧酸酯酶1基因的起始翻譯。吳雪瓊等[22]發現，rs8192950 AC基因型和rs1968785 GG基因型在中國人群中是AT-DILI的保護因素。

3.1.2Ⅱ相代謝酶 Ⅰ相反應產生了一系列肝細胞毒性產物，需要Ⅱ相反應解毒，Ⅱ相反應解毒過程需要特異性轉移酶的參與，而特異性轉移酶基因多態性會影響酶活性，當酶活性發生改變時，會影響AT-DILI的發生。

NAT2參與外源性物質的乙酰化。其等位基因分為慢乙酰化等位基因(NAT2*5 NAT2*6 NAT2*7NAT2*14)和快乙酰化等位基因(NAT2*4、NAT2*11、NAT2*12、NAT2*13)[11,23]。依據單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)多態性，NAT2基因分為慢乙酰化基因型、快乙酰化基因型、中間乙酰化基因型[24-25]。國外相關研究發現，NAT2慢乙酰化基因型會增加AT-DILI的發病風險[26-28]，與國內研究結論一致[29]。動物實驗發現，慢乙酰化基因型小鼠異煙肼的慢乙酰化代謝產物可與機體內的某些物質(脂肪酸、維生素B6)有交互作用[30]。

GSTs可以防止氧化應激對細胞造成的損傷。其通過促進抗結核藥物的中間代謝產物與谷胱甘肽結合，使之排出體外，從而達到解毒的作用。因此，肝細胞缺乏GSTs會增加AT-DILI的發病風險。與AT-DILI發病相關的基因型主要為GSTM1和GSTT1。在印度人群中發現，GSTM1純合子缺失基因型AT-DILI風險系數高[31]。而在西班牙人群中的研究提示，AT-DILI與GSTM1無顯著聯系[30]，安慧茹[31]、黃倩等[32]的研究也得出類似結論。祖麗婭·沙塔爾等[33]的研究雖然沒有發現單獨GSTT1基因型與AT-DILI的關系，但發現了GSTM1、GSTT1同時缺失基因型會影響AT-DILI 的發生。關于GSTs與AT-DILI的關系，國內外研究結果不一，這可能與地域、民族、樣本量等差異有關，因此需要更多的研究去驗證GSTs與AT-DILI 之間的關系。

3.2代謝產物轉運蛋白與AT-DILI易感性 AT-DILI的發生可影響肝臟的正常代謝功能，導致相關代謝產物在肝內的積聚，如膽汁酸、脂肪酸和含鐵血黃素，從而進一步損傷肝臟。與代謝產物積聚有關的蛋白質主要有CYP7A1、BSEP/ABCB11、SLC、UGTs、PXR。與編碼這些蛋白相關的基因發生突變會影響AT-DILI的發生與發展。

CYP7A1催化膽固醇在肝臟分解為膽汁酸[34]。一項研究數據表明，CYP7A1SNP (rs3808607)與結核感染密切相關[35]。另有研究發現，CYP7A1基因多態性影響AT-DILI的發生[36]。動物實驗表明，CYP7A1的高表達促進膽汁酸的高分泌，從而增加肝損害[37]。

BSEP是肝細胞分泌膽汁酸的運載體，BESP蛋白的表達可影響膽鹽分泌、改變膽汁的形成，導致膽汁淤積甚至膽結石的形成，其基因多態性影響相關蛋白表達，可能對AT-DILI 的發生起作用[38]。

SLC轉運體的主要作用是參與肝細胞攝取肝血竇中外源性化合物，同時也可參與結合型膽汁酸的調控，其調控可分為非鈉依賴性途徑和鈉依賴性途徑。前者主要為有機陰離子轉運蛋白和由SLC01B1編碼的有機陰離子轉運多肽家族的成員；后者主要為SLC10A1編碼的牛磺膽酸鈉共轉運多肽。抗結核藥物進入肝臟后，需要從肝血竇進入肝細胞進行代謝，而有機陰離子轉運多肽可將藥物從肝血竇轉移到肝細胞中，所以編碼有機陰離子轉運多肽的基因SLC0B1發生突變，會影響藥物的藥動學。SLC01B1基因521位點T>C突變，會增加AT-DILI的發病風險[39]。此外，SLCO1B1*15單倍體與AT-DILI患病風險增加有關[38]。

UGTs是外源物質在生物體內進行Ⅱ相代謝的生物轉化酶。體內游離的膽紅素為脂溶性，不能被腎小球濾過。游離膽紅素在UGTs的作用下與葡萄糖酸結合，形成水溶性的結合膽紅素，從而可通過尿液排泄。在肝臟表達的UGTs主要為UGT2B7，且存在于UGT2B7基因編碼區和啟動子區的基因多態性與遺傳易感性密切相關，UGT2B7-268、802位點基因多態性會增加AT-DILI的發病風險，且野生型攜帶者發生AT-DILI的風險明顯高于802位點突變型純合子TT攜帶者和UGT2B7基因268位點突變型雜合子AG攜帶者[40]。此外，UGT1A1*27和UGT1A1*28的基因多態性也與AT-DILI的發生有關[41]。

PXR是重要的核受體，其能夠調節藥物代謝酶基因的表達。PXR(rs2461823和rs7643645)遺傳多態性增加了AT-DILI的發生風險[42]，其中PXR(rs7643645)基因突變可能通過降低肝細胞核因子4α的親和力來抑制PXR，從而影響AT-DILI[43]。動物實驗發現，大鼠PXR激活劑能增強異煙肼導致的大鼠肝毒性，其機制可能與激活劑上調CYP3A的活性有關[44]。

3.3免疫因子與AT-DILI易感性 免疫反應可通過外在途徑引起線粒體通透性轉換，從而引起肝細胞凋亡或壞死。與AT-DILI相關的免疫因子主要有HLAs、TNF-α、IL-6/STAT3通路。

3.3.1HLAs HLAs是一種編碼主要組織相容性復合體的表達產物。HLA基因被分為主要組織相容性復合體Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三種。其中，主要組織相容性復合體Ⅰ型基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，主要組織相容性復合體Ⅱ型基因包括HLA-DQA1/B1和HLA-DRA1/B1。當主要組織相容性復合體基因正常時，藥物蛋白不觸發抗原呈遞細胞。然而當HLA基因發生突變時，抗原呈遞細胞表面發生變化，藥物蛋白激活抗原呈遞細胞，從而激活T細胞導致肝細胞損傷反應。許多研究發現了HLAs基因多態性與AT-DILI發病之間的相關性，HLA-DQB1* 05/*05基因型可增加AT-DILI的發病風險[45]，且AT-DILI患者HLADQA1*03∶02、HLA-DRB1*08∶01或HLA-DQB1*08∶03的等位基因頻率高于非AT-DILI人群[46]。

3.3.2TNF-α TNF-α是一種具有廣泛生物學活性的炎癥因子，由單核巨噬細胞產生，在藥物引起的免疫反應中起重要作用。TNF-α轉錄起始點上游的308G/A突變可使TNF-α水平升高[47]。動物實驗發現，異煙肼組的TNF-α信使RNA和蛋白表達隨灌胃時間的延長逐漸升高[48]。因此，抗結核藥物可通過影響TNF-α的轉錄過程，影響TNF-α蛋白的表達，從而影響AT-DILI 的發生與發展。

3.3.3IL-6/STAT3信號通路 IL-6/STAT3通路是調節肝臟細胞再生的重要通路。IL-6是一種具有調節細胞增殖和分化、調控炎癥反應、免疫防御等多種生物功能在內的常見細胞因子。STAT3是一類重要的轉錄因子，參與細胞信號轉導和轉錄激活。生長因子、干擾素等多種外源性信號刺激可激活JAK-STAT3信號通路，從而調控下游諸多靶基因的表達，參與免疫調節及細胞的增殖、分化、凋亡等生物學過程。在肝臟中，IL-6可以激活STAT3信號通路，調控下游靶基因(Bcl-2、Bcl-xL、Fas相關死亡域樣白細胞介素-1β轉換酶抑制蛋白等)活化，進而阻斷Fas/Fas配體誘導的細胞凋亡途徑，發揮保護肝臟的作用[49]。其中，IL-6/STAT3信號通路中IL-6基因SNPrs2066992和STAT3基因SNPrs1053023與AT-DILI的發生有關[50]。

3.4氧化應激酶及氧化應激因子與AT-DILI易感性 肝細胞中的氧化應激反應最終會引起肝細胞的凋亡或壞死。與AT-DILI相關的氧化應激途徑有TXNRD1、SODs、Nrf2-ARE信號通路。

TXNRD1是一種抗氧化應激的關鍵酶，是硫氧還蛋白和二氧化硒的主要代謝酶，可保護細胞免受氧化應激損傷。研究表明，TXNRD1基因中有幾個SNP位點均與藥物引起的肝損傷發展有關，包括抗結核藥物、抗生素和抗癲癇藥物[51]。另有研究也發現，TXNRD1基因多態性與AT-DILI易感性相關[52]。

SODs可將活性氧類代謝為過氧化氫，在藥物代謝中發揮解毒作用。在過氧化氫酶的作用下，過氧化氫又可被過氧化氫酶和過氧化物酶代謝生成水，因此SOD具有抗氧化應激作用。研究發現，SNP rs2070424與AT-DILI顯著相關[53]。有學者在國內人群中發現，AT-DILI患者SODs基因47位C/C基因頻率明顯升高[54]。動物實驗發現，抗結核藥物治療后，SD大鼠肝臟勻漿的SODs水平顯著降低，造成肝臟代謝負擔明顯加重，肝臟毒性亦隨之增加[55]。

Nrf2-ARE信號通路氧化應激是許多肝臟疾病發生的共同機制。Keap1是亮氨酸拉鏈家族中調節氧化應激反應的重要轉錄因子Nrf2的特異性受體。在正常生理狀態下, Keap1通過與Nrf2 的N端特異性結合，抑制Nrf2的活性，此時細胞內抗氧化物和Ⅱ相酶類處于基礎表達水平，細胞狀態穩定。而活性氧或其他親電試劑刺激會使Keap1與Nrf2解偶聯，Nrf2轉移進入細胞核，與核內小Maf蛋白結合，形成異二聚體。異二聚體識別并結合ARE，進而啟動下游Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化保護性基因的轉錄，包括還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化還原酶、血紅素加氧酶1、環氧化物水解酶、GSTs和谷氨酸半胱氨酸連接酶等，見圖3。機體和細胞在這些酶的保護下可免受活性氧類及一些毒性物質(致癌物、藥物活性代謝產物等)的侵害。此外，磷脂酰肌醇-3-激酶、促分裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶C也可激活該通路，這主要由于Nrf2的絲氨酸和蘇氨酸殘基可被酪氨酸蛋白激酶磷酸化，從而使Nrf2與Keap1解偶聯，Nrf2轉位入核，結合ARE激活Nrf2-ARE信號通路[56]。

在Nrf2-ARE信號通路中，MAFK基因rs4720833GA或AA基因型、一氧化氮合酶2A基因rs110800344CC基因型及BTB-CNC異體同源體基因rs2070401CC基因型是導致AT-DILI發生的獨立危險因素。目前，藥物途徑和基因途徑兩種主要途徑可以激活Nrf2-ARE信號通路。其中，Keap1-KO、Keap1-CKO以及Keap1-KD是Nrf2的主要基因激活途徑。研究發現，腹腔注射高劑量(700 mg/kg)對乙酰氨基酚會使Keap1-CKO小鼠肝臟中的Nrf2及其下游靶基因谷氨酸半胱氨酸連接酶、GSTs、NAD(P)H 醌氧化還原酶1的表達明顯增加，可抵制對乙酰氨基酚引發的肝臟毒性[57]。

Nrf2：核因子E2相關因子2；ARE：抗氧化反應元件；HO-1：血紅素氧化酶；NQO1：NAD(P)H 醌氧化還原酶1；GCL：谷氨酸半胱氨酸連接酶；GST：谷胱甘肽硫轉移酶；EH：環氧化物水解酶

圖3 Nrf2-ARE信號通路

4 小 結

結核病是一個全球性的公共衛生問題，世界上每年有1 000多萬人受到結核病的影響。抗結核藥物的聯合使用可以有效控制結核的病情發展。然而，這種聯合療法也會導致嚴重的不良反應。藥物代謝酶、代謝產物轉運蛋白、免疫因子、氧化應激酶及氧化應激因子多種基因的多態性與AT-DILI易感性有關。其中，CYP2E1、NAT2基因多態性影響著AT-DILI的發生；雖然對GSTs相關基因多態性的研究也很多，但結果不一，這可能與地域、民族、樣本量等的差異有關。目前，對與膽汁酸、脂肪酸、血色素等代謝產物積聚、氧化應激、免疫反應相關的基因多態性研究較少，未來需開展大樣本、多種族、多中心的風險評估研究，進一步研究其與AT-DILI易感性的關聯，以指導臨床用藥，調整不同基因型個體用藥方案，從而預防AT-DILI的發生。