正交試驗法優選身痛逐瘀湯顆粒的提取工藝

周維利，公為紅，王 坤

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101）

身痛逐瘀湯是清代名醫王清任《醫林改錯》[1]中的五大逐瘀湯之一，己入選國家中醫藥管理局公布的第一批100種古代經典名方目錄[2]，原文記載，“凡肩痛、臂痛、腰痛、腿痛，或周身疼痛，總名曰痹癥。明知受風寒，用溫熱發散藥不愈；明知有濕熱，用利濕降火藥無功。久而肌肉消瘦，議論陰虧，隨用滋陰藥又不效。至此便云：病在皮脈，易于為功；病在筋骨，實難見效。因不思風寒濕熱入皮膚，何處作痛。入于氣管，痛必流走；入于血管，痛不移處。如論虛弱，是因病而致虛，非因虛而致病?！欧筋H多，如古方治之不效，用身痛逐瘀湯”。組方為白秦艽一錢，川芎二錢，桃仁三錢，紅花三錢，甘草二錢，羌活一錢，沒藥二錢，當歸三錢，靈脂二錢（炒），香附一錢，牛膝三錢，地龍二錢（去土），水煎服。據學者邱隆等[3-6]考證，清代1兩約合37.3 g，每處方折合現代劑量約92.5 g，適宜成顆粒劑，便于患者服用。

身痛逐瘀湯顆粒至今未見有關制劑提取方面報道，本實驗以川芎和當歸中阿魏酸和紅花中的羥基紅花黃色素A含量為評價指標，對提取工藝進行了優化，現報道如下。

1 儀器與材料

儀器：FA1204C電子分析天平（上海天美天平儀器有限公司），高效液相色譜儀（日本島津），LC-15C泵，SPD-15C檢測器，島津Shimpack VP-ODS（C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

對照品：阿魏酸（10 mg，110773-201614）；羥基紅花黃色素A（10 mg，111637-201609）圴購自中國食品藥品檢定研究院。

試劑：乙腈、甲醇和磷酸為均為色譜純，水為重蒸去離子水，其余試劑均為分析純。

藥材：均購自濟南漱玉平民大藥房有限公司。

2 方法與結果

2.1 水提正交試驗設計

分別按身痛逐瘀湯顆粒處方稱取白秦艽18.5 g，川芎37 g，桃仁55.5 g，紅花55.5 g，甘草37 g，羌活18.5 g，沒藥37 g，當歸55.5 g，靈脂（炒）37 g，香附18.5 g，牛膝55.5 g，地龍（去土）37 g，共9份，每份計462.5 g，參考相關文獻[7-9]，選取加水量、提取次數與時間3個因素，每個因素3個水平，進行L9(34)試驗，以提取液中阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量為指標進行評價，因素水平表見表1。

表1 因素水平表

2.2 阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量測定[10-11]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：島津Shimpack VP-ODS（C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相（A）乙腈-0.05 %磷酸（B）遞度洗脫，檢測波長0～15 min，210 nm；15～100 min，290 nm；50～50 min，254 nm，流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl，遞度洗脫系統見表2。

表2 梯度洗脫系統

2.2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取阿魏酸和羥基紅花黃色素A對照品適量，置入棕色量瓶，加50 %甲醇制成每1 ml含阿魏酸8 μg和羥基紅花黃色素A 100 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密移取提取液10 ml，水浴蒸至近干，加50 %甲醇20 ml，分次轉移至25 ml量瓶，超聲處理（功率200 W，頻率50 kHz）30 min，冷卻至室溫，加50 %甲醇至刻度，取續濾液即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 按身痛逐瘀湯顆粒提取方法制備陰性提取液，方法同2.2.3項，得陰性樣品溶液。

2.2.5 線性與范圍 取阿魏酸和羥基紅花黃色素A對照品溶液，注入高效液相色譜儀，以濃度C（μg/ml）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線，阿魏酸回歸方程為A=398 301C-206 698，R2=0.9996；在1.516～13.644 μg/ml濃度范圍內，阿魏酸峰面積值與濃度具有良好線性關系；羥基紅花黃色素A回歸方程為A=550 306C-272 081，R2=0.9997；在20.01～181.26 μg/ml濃度范圍內，羥基紅花黃色素A峰面積值與濃度具有良好線性關系。

2.2.6 精密度試驗 取阿魏酸對照品溶液（7.58 μg/ml）與羥基紅花黃色素A對照品溶液（100.7 μg/ml）分別注入高效液相色譜儀，連續進樣6次，峰面積RSD為0.47 %與0.62 %，儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 取身痛逐瘀湯顆粒樣品6份，按“2.2.3供試品溶液制備”，進行含量測定，計算阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量RSD，含量RSD為1.56 %與1.31 %，方法重復性良好。

2.2.8 穩定性試驗 取同一身痛逐瘀湯顆粒溶液分別于0，3，6，9和12 h進樣，記錄峰面積，計算峰面積積分值的RSD，結果RSD為1.15 %與1.23 %，供試品溶液在12 h內穩定。

2.3 最佳工藝確定

正交試驗結果見表3，方差分析結果見表4。以提取液中阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量為提取評價指標，影響因素大小均為A＞B＞C，因素A2與A3、B2與B3、C2與C3均無明顯差別，直觀最佳工藝為A3B3C3（加8倍量水提取3次，每次80 min），綜合考慮，優選工藝為A2B2C2（加7倍量水提取2次，每次60 min）。

表3 正交試驗設計與結果

表4 羥基紅花黃色素A含量方差分析

2.4 工藝驗證

稱取身痛逐瘀湯顆粒處方中各藥材6份，每份462.5 g，分別按A3B3C3（加8倍量水提取3次，每次80 min）和A2B2C2（加7倍量水提取2次，每次60 min）各提取3次，結果見表5。

表5 提取工藝驗證試驗結果表

結果表明，直觀工藝與優選工藝無明顯差異，最終確定提取工藝為藥材加7倍量水提取2次，每次60 min，該提取工藝驗證3次，阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量穩定。

3 討論

3.1 古代經典名方中藥復方制劑簡化注冊審批管理規定經典名方制劑的制備方法應與古代醫籍記載基本一致，為保持經典名方傳統醫藥的特點，結合處方中有效成分的理化性質，選擇了水提取法，通過預實驗發現藥材浸泡24 h后吸水量約為藥材的2倍，浸泡時間多于30 min時對提取結果幾乎沒有影響，為了提高提取效率，藥材均浸泡30 min。根據預實驗結果，加水量于藥材量5倍與多于8倍量藥材時，提取效果均不理想。故正交試驗提取中加水量6、7、8倍量3個水平進行了正交試驗設計優選，并對處方中藥材的有效成分阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量做了測定，優選出了較為合理的提取工藝。

3.2 身痛逐瘀湯顆粒由十二味中藥組成，提取液成分復雜且極性跨度大，當歸、川芎共同主要成分是阿魏酸，紅花主要成分是羥基紅花黃色素A，采用梯度洗脫可使檢測峰得到良好分離。