防栓合劑抗血栓形成作用研究*

王永周，黃 琴，鐘麗君，姚 菲，賀曉霞，蒲青榮

西南醫科大學附屬中醫醫院(瀘州 646000)

防栓合劑是由黃芪、黨參、丹參、赤芍、當歸、桃仁、紅花、川芎、枳實、酒大黃、川牛膝等益氣活血藥物制備而成的一種院內制劑。前期臨床研究[1]表明，防栓合劑可以較好地減少術后深靜脈血栓(DVT)的發生，降低DVT的發生率。本實驗主要研究防栓合劑對動物血栓形成、凝血功能及腸道運動障礙的影響，以探討其在預防手術后血栓形成中的作用，為今后在臨床的廣泛應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試品及配制方法 防栓合劑，深棕色流浸膏，每毫升浸膏含原生藥3.04 g，批號：20161011，由敘永縣中醫醫院提供。臨用時用去離子水配制成所需濃度的混懸液備用，本實驗劑量按原生藥g·kg-1計算。

1.1.2 主要試劑 鹽酸腎上腺素注射液[遠大醫藥(中國)有限公司，批號：160406]；角叉菜膠(美國Sigma公司，批號：SLBL2288V)；硫酸阿托品注射液(河南潤弘制藥股份有限公司，批號:1608251)；阿司匹林腸溶片(德國拜耳醫藥保健有限公司，批號：BJ30648)；多潘立酮片(西安楊森制藥有限公司，批號：021075A)；水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠，批號：2016020101)；氯化鈉注射液(昆明南疆制藥有限公司，批號：C160229D)。

1.1.3 試驗動物 KM種小鼠，SPF級，SD大鼠，SPF級，四川省中醫藥科學院試驗動物中心提供，合格證號：SCXK(川)2013-19。

1.1.4 主要儀器及耗材 凝血酶原時間(PT)試劑盒，批號：0916051；部分激活促凝血酶時間(APTT)試劑盒，批號：0616061；凝血酶時間(TT)試劑盒，批號：0616031，以上試劑盒均由四川邁克生物科技有限公司提供。一次性使用人體靜脈血樣采集容器(檸檬酸鈉9∶1)(湖南省瀏陽市醫用儀具廠，批號：B45350353)；一次性使用血樣采集針(山東奧賽特醫療器械有限公司，批號：20161004)；半自動血凝分析儀(CD-4001，德國藍波)；電子天平(JY10001，上海良平儀器儀表有限公司)。

1.1.5 劑量設置依據 防栓合劑臨床劑量為150 g/d，即人用劑量為2.14 g·kg-1(按照70 kg體重計算)，按照體表面積法折算成小鼠的等效劑量約為19.5 g·kg-1，因此小鼠設高(40 g·kg-1)、中(20 g·kg-1)、低(10 g·kg-1)3個劑量組。小鼠藥效學試驗有效劑量為10 g·kg-1，對應大鼠的劑量約為7 g·kg-1，因此大鼠設高(16 g·kg-1)、中(8 g·kg-1)、低(4 g·kg-1)3個劑量組。

1.1.6 試驗環境 四川省中醫藥科學院試驗動物中心SPF級動物房，試驗動物使用許可證號：SYXK(川)2013-100。四川省中醫藥科學院藥理毒理所國家中醫藥管理局中藥藥理三級試驗室(TCM-2009-325)。

1.2 試驗方法

1.2.1 防栓合劑對小鼠體內血栓形成的影響 KM種小鼠50只，♂，SPF級，初始體重(20±2)g。適應性喂養后按體重隨機分為5組：模型組、防栓合劑組(40、20、10 g·kg-1)、阿司匹林組(100 mg·kg-1)，每組10只。各組灌胃去離子水或相應藥物5次，2次/d，末次給藥后30 min在小鼠腰背部皮下注射角叉菜膠生理鹽水溶液40 mg·kg-1，保持室溫<18 ℃，72 h后觀察小鼠尾部血栓形成情況，計算血栓形成率及血栓相對長度[2]。血栓相對長度=血栓長/尾長×100%。

1.2.2 防栓合劑對高凝狀態下大鼠凝血的影響 SD大鼠60只，♂，SPF級，初始體重(160±20)g。適應性喂養后按體重隨機分為6組：空白組、模型組，防栓合劑高、中、低劑量組(16、8、4 g·kg-1)及阿司匹林組(80 mg·kg-1)。各組灌胃去離子水或相應藥物7 d，1次/d，于第6次給藥后30 min皮下注射0.8 mg·kg-1鹽酸腎上腺素，2 h后冰水浸泡5 min，2 h后再于皮下注射鹽酸腎上腺素0.8 mg·kg-1，對照組注射等體積氯化鈉注射液。禁食不禁水18 h，末次給藥30 min后，300 mg·kg-1水合氯醛腹腔注射麻醉，由腹主動脈取血測PT、APTT、TT和凝血時間(CT)[3]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 防栓合劑對小鼠體內血栓形成的影響

2.2 防栓合劑對高凝狀態下大鼠凝血的影響

模型組大鼠PT、APTT均較對照組短(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，防栓合劑高、中劑量組大鼠的PT均延長，防栓合劑中、低劑量組大鼠的APTT延長，防栓合劑中、低劑量組大鼠CT明顯延長(P<0.05，P<0.01)(表2)。

表1 防栓合劑對小鼠體內血栓形成的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

表2 防栓合劑對高凝狀態下大鼠凝血的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

本實驗所用防栓合劑是在圣愈湯、桃紅四物湯等的基礎上，經過科學合理的篩選組方而成。該方通過黃芪、黨參補脾肺之氣，氣為血帥，氣行則血行，再配以桃紅四物湯，既可活血化瘀而去瘀通絡，又可養血而濡氣，使補中有動，行中有補，佐以川牛膝，引藥下行，活血通絡，而使血脈暢通。枳實、酒大黃行氣通腑、助脾運化，使患者術后盡快恢復脾胃之氣，而中氣建立，則臟腑之氣旺，更有助于體內氣血運行，而無“脈痹”之虞。

現代藥理學研究[4]表明，活血化瘀藥能通過降低血小板聚集、改善血液流變特性、減低血液黏度等方面改善血小板反應性改變出現的高凝狀態，從而抑制血栓形成。方中黃芪具有益氣、固表、利水的功效。研究[5]表明黃芪可能通過抑制血管內皮細胞PAI-1表達和活性發揮抗血栓作用。丹參主要成分為丹參酮、丹參素、原兒茶醛的活性物質，具有抗血小板聚集和血栓形成、抗凝血功能，促進纖維蛋白原降解，對紅細胞及多種原因引起的溶血有明顯的保護作用，可改善血黏度[6]；赤芍主要成分為芍藥總苷、鞣質類、黃酮類、揮發油的活性物質，具有抗腫瘤、抗凝、抗血栓、抗氧化作用[7]。當歸素有“藥王”之稱，主要成分為多糖及阿魏酸、藁苯內酯、氨基酸、微量元素的活性物質，具有抗氧自由基、增強機體免疫力及抑制炎癥、抗血小板聚集、降低血液黏稠度的作用[8]；川芎揮發油是川芎的重要藥效部位，其主要成分為阿魏酸、藁苯內酯、苯酞、烯萜醇與脂肪酸類化合物，具有改善血管功能、保護神經細胞、鎮痛鎮靜解熱等藥理作用[9]。桃仁主要成分為黃酮、苷類，甾醇及其蛋白質、氨基酸活性物質具有抗凝血、抗血栓、抗炎、抗氧化作用[10]；紅花主要成分為黃酮類、生物堿、有機酸、聚炔、木脂素活性物質，具有抑制血小板激活因子誘發的血小板聚集與釋放、抗炎鎮痛、增強機體耐力的作用[11]。枳實主要成分為黃酮苷、揮發油，生物堿生物活性具有抗疲勞的藥理作用[12]；酒大黃主要成分為大黃素，具有抗炎和免疫抑制作用，可提高血漿滲透壓，補充血容量，降低血液黏度，有利于解除微循環障礙[13]；川牛膝主要成分為脫皮甾醇、皂苷，具有抗凝血、抗腫瘤、調節機體免疫功能、抗衰老、抗炎鎮痛等藥理作用[14]。研究[15]表明丹參、川芎和紅花 3 味中藥在活血化瘀中成藥中配伍使用最為頻繁。含有丹參、川芎和紅花的活血化瘀中成藥的抗血栓作用,主要與其抑制炎癥反應有關，抑制炎癥相關分子 NOS2、PTGS2、IL-6、TNF 和 IL-1β及其相關通路。APTT反應內源性凝血系統的凝血功能,因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的水平及活性變化可直接影響APTT的水平；PT反映外源性凝血系統的凝血功能，既可反映血漿凝血酶原的水平,又可反映凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的水平及活性；TT反應凝血、抗凝血及纖維蛋白溶解系統功能[16-18]。

綜上所述，本研究表明防栓合劑具有抗血栓形成及抗凝的作用，其機制可能是影響外源性及內源性凝血系統活性，但具體作用于凝血過程的環節有待進一步研究。