消癌平注射液對大鼠體內多西紫杉醇藥動學的影響研究*

余 彬，饒友義，寧 紅，高秀容，許小紅，黃毅嵐

1.西南醫科大學附屬醫院 藥學部(瀘州 646000);2.綿陽市中心醫院 藥學部(綿陽 621000);3.成都醫學院 藥學院(成都 610500)

藥物治療是抗腫瘤的有效方法之一，其中藥物的聯合使用尤為重要。多西紫杉醇(docetaxel, DTX)又名多西他賽，是紫杉烷類第二代抗癌藥[1-3]，其療效優于紫杉醇。作為臨床常用的抗腫瘤一線藥物，也常與其他抗腫瘤藥物進行聯合使用治療腫瘤，其中包括抗腫瘤中藥注射液。消癌平注射液取自烏骨藤的根和藤莖，并經提取而制成[4]，具有能夠殺滅多種腫瘤細胞、抑制腫瘤生長的作用，與化療藥物聯合使用可明顯增強化療療效，降低化療引起的不良反應[5]。

目前，中西藥聯用治療惡性腫瘤的情況日益普遍[6]，其中也包括DTX注射液聯用消癌平注射液，而DTX需經CYP3A4酶進行代謝[7]，而本團隊前期研究[8]結果表明消癌平對CYP3A4酶具有抑制作用，因此當兩藥聯合使用時，DTX代謝很可能會被抑制，引起血藥濃度增加及療效的增強，但仍缺乏進一步的相關研究進行佐證。故本團隊以大鼠作為研究對象，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法探討消癌平對DTX大鼠體內藥動學的影響，進一步驗證消癌平對DTX的抑制作用，并為兩藥在腫瘤患者的聯合使用提供實驗依據和指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，體重(200±10) g，共計24只，并采用計算機隨機分為4組，每組6只大鼠，4組大鼠分別編為分為A、B、C、D組，大鼠由西南醫大實驗動物中心提供，動物的許可證為SCXK (川)2012-17。大鼠采用分籠飼養，1籠1只，每日給予食物和水。大鼠在實驗室動物實驗中心，實驗中心相對濕度在40%～60%之間，室溫控制在(23±3)℃。

1.2 藥品與試劑

消癌平注射液(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，規格：0.5 mL∶20 mg，批號15111215)；DTX對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度98.4%，批號100666-201403)；紫杉醇對照品(中國食品藥品檢定研究院，質量分數99.9%，批號100382-201603)。乙腈、甲醇為色譜純；水為重蒸餾水；其余為分析純。

1.3 儀器

HPLC儀(Ultimate 3000型，德國戴安公司)；醫用離心機(G16型，北京白洋醫療器械有限公司)；旋渦混合器(HX-B型，江蘇康健醫療用品有限公司)；電子天平(ME104型，德國Sartorius公司)。

1.4 藥動學實驗設計

大鼠給藥前禁食不禁水12 h，A組大鼠僅給予DTX；B組大鼠給予DTX及消癌平(低劑量)；C組大鼠給予DTX及消癌平(中劑量)；D組大鼠給予DTX及消癌平(高劑量)。其中A組為空白組，B組為低劑量組，C組為中劑量組，D組為高劑量組。通過不同種屬之間的藥物劑量換算并依據預試驗結果，確定給予大鼠的DTX劑量為13.3 mg/kg， 消癌平的中劑量為5 mL/kg，依據中劑量開展預實驗確定大鼠的另外兩個劑量，最后確定消癌平的高劑量為中劑量的1.5倍，低劑量為中劑量的0.5倍。4組大鼠的DTX和消癌平分別前后給藥，消癌平在注射DTX前12 h進行給藥，藥物經尾靜脈注射，并于給藥后在不同的時間點進行取血，依據的時間點為5、15、30 min和1、2、3、4、5、6、8、10 h， 取血量約0.5 mL， 并將采取得血樣置于離心管中，隨即進行離心，分離后將血漿于-20℃冰箱內保存至測定。

1.5 HPLC測定方法

1.5.1 標準曲線溶液和質控(QC)樣品溶液制備 1)標準曲線工作液：精密稱取DTX對照品3.0 mg置于10 mL量瓶中，采用有機溶劑-甲醇進行溶解，及定容至刻度線，得300 mg/L DTX儲備液。儲備液用甲醇-水(50∶50,V/V)稀釋，配制在0.781 3～100.0 mg/L質量濃度范圍內的系列標準曲線工作液。2)內標溶液：精密稱取一定量DTX，用甲醇溶解定容，配制30.0 mg/L內標溶液。3)標準曲線溶液：分別將系列標準曲線工作溶液50 μL加入至50 μL空白大鼠血漿中，混勻得質量濃度為0.39、0.78、 1.56、3.12、6.25、 12.50、25.00、50.00 mg/L系列標準曲線溶液。4)質控(quality control,QC)樣品溶液：配制方法方法同標準曲線溶液，得質量濃度分別為1.56、6.25、25.00 mg/L的QC樣品溶液。

1.5.2 色譜條件 色譜柱為Nucleodur C18色譜柱(規格：5 μm,4.6 mm×250 mm)；流動相為50%的乙腈水溶液；檢測波長為233 nm；流速為1 mL/min；柱溫為室溫。

1.5.3 血漿樣品的處理和測定 取大鼠空白血漿約0.2 mL置于離心管內，并在離心管中加入內標液(紫杉醇)30 μL和1 mL的三氯甲烷后進行3 min的渦旋，隨即在轉速為6 000 r/min，離心半徑10 cm的離心機內離心10 min，完畢后將有機層轉移至另一離心管內，于離心管內加入50%的乙腈水溶液并在氮氣下直至吹干，隨后在轉速為3 000 r/min，離心半徑10 cm的離心機內離心20 min， 離心后取20 μL進行分析，記錄色譜圖。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 方法專屬性考察

DTX、紫杉醇的保留時間分別為12.13、15.21 min，兩峰完全分離，且分離度R>1.5，DTX的對稱因子0.98，理論塔板數為9 400，紫杉醇的對稱因子為1.02，理論塔板數為11 000，且無其他干擾物質存在，表明本色譜方法專屬性良好(圖1)。

2.2 標準曲線和最低定量限(lower limit of quantification，LLOQ)

計算DTX面積與內標峰面積的比值Y(As/Ai)，以Y作為縱坐標，血漿中DTX質量濃度C(ng/mL)為橫坐標，進行加權(權重1/C2)回歸，得到DTX的標準曲線方程、相關系數r如下：Y=8.101 3X-3.265 2，r=0.999 3，最佳權重為: 1/C2。

在0.39～25.00 mg/L質量濃度范圍內，DTX與內標峰面積比值與DTX質量濃度有良好的線性關系，LLOQ為0.19 mg/L。

2.3 精密度

高、中、低3種質量濃度的DTX連續3 d 內日間精密度的相對標準偏差(RSD)分別為3.12%、3.68%、7.66%；日內精密度的RSD值分別為3.84%、3.15%、6.38%(表1)。

圖1 高效液相色譜圖注：A：空白血漿；B：空白血漿+DTX(6.25 mg/L)與內標液；C：大鼠靜脈注射DTX 1 h后的血漿

質量濃度/(mg/L)日間精密度實測值RSD/%日內精密度實測值RSD/%1.561.51±0.127.661.52±0.106.386.255.89±0.223.676.15±0.193.1525.0024.66±0.773.1224.36±0.803.84

2.4 回收率

高、中、低3種濃度的DTX回收率的RSD分別為6.44%、3.82%、3.19%(表2)。

表2 待測組份在大鼠血漿中的回收率

2.5 穩定性

參照SFDA“化學藥物非臨床藥代動力學研究技術中的相關技術”指導原則，對高(25 mg/L)、低(1.56 mg/L)兩個濃度樣品的穩定性進行考察，以確保實驗結果的準確可靠。分別考察DTX血漿樣品在不同條件下的穩定性，考察條件包括：樣品置于室溫下避光放置6 h、樣品1周內連續反復凍融3次、 樣品置于-20 ℃冰箱中分別凍存15 d以及30 d，和處理后的樣品放在自動進樣架上(12 h，15 ℃)的穩定性考察，在各條件下測得的RSD值均小于8%(表3)。

表3 各條件下穩定性的RSD(%,n=6)

2.6 藥動學研究

4組大鼠在給藥后，DTX的血藥濃度為縱坐標，時間為橫坐標繪制濃度-時間曲線圖，藥動學參數采用DAS2.1.1軟件擬合(圖2、表4)。

藥代動力學參數按非房室模型進行擬合，從上表結果可知，B、C、D 3組的t1/2(α)、CL分別與A組相比，差異均無統計學意義(P>0.05)，說明消癌平對DTX的t1/2(α)以及CL沒有任何影響；僅D組的t1/2(β)與A組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，說明D組的消除半衰期有所延長，其余兩組的消除半衰期沒有影響；C組和D組的AUC、Cmax、MRT與A組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，說明中劑量組和高劑量組的AUC和Cmax增大，MRT延長，低劑量組未受影響。因此結合以上參數結果，當兩藥聯合使用時，高劑量組的DTX t1/2(β)延長，中劑量組和高劑量組的DTX AUC、Cmax增大，MRT延長，CL和t1/2(α)未受影響，說明在DTX在與消癌平合用時，DTX的清除減慢，導致血藥濃度增大，這也進一步證實了本團隊的期前研究結果，消癌平對DTX的消除具有抑制作用[8]。

圖2 DTX在大鼠體內的藥-時曲線圖

注：A：空白組與低劑量組大鼠給予藥物后DTX的血藥濃度；B：空白組與中劑量組大鼠給予藥物后DTX的血藥濃度；C：空白組與高劑量組大鼠給予藥物后DTX的血藥濃度；D：4組大鼠給藥后DTX的血藥濃度

表4 DTX的藥動學參數

注：與A組比較，*P<0.05

3 討論

3.1 關于色譜條件的確定

色譜條件的確定有以下幾個要點：1)DTX的對稱因子較好；2)DTX和內標峰互補干擾，也都不被血漿雜質峰所干擾；3)DTX以及內標峰的各自分離度(R)≥1.5；4)出峰時間較短。依據上述要求，并結合已有的實驗條件及參考相關文獻[9-13]進行預實驗，最終確定色譜條件為色譜柱。Nucleodur C18柱(規格：5 μm, 4.6 mm×250 mm)；流動相為50%的乙腈水溶液；檢測波長為233 nm；流速為1 mL/min；柱溫為室溫。

3.2 關于動物試驗中給藥劑量的設計

按照說明書中DTX用量，成人的常用劑量為75～100 mg/m2，根據文獻[14]和劑量換算公式，以及預實驗，最終確定給予大鼠的靜脈注射劑量為13.3 mg/kg。說明書中成人消癌平的給藥劑量為0.33～1.67 mL/kg，根據文獻[15-17]和劑量換算公式，以及預實驗，確定給予大鼠消癌平的劑量(中劑量)為5 mL/kg。

3.3 內標物的選擇

在目前對DTX的HPLC研究中，內標物的選擇也多種多樣；大多采用地西泮作為內標物[14,18-19]。但本研究以紫杉醇作為內標物，紫杉醇是在DTX的結構上改造而成，且兩藥的藥效作用相似。同時本研究的色譜條件下，內標峰的峰型對稱良好并不受干擾，也未干擾主峰，R滿足需求，且出峰時間早，因此本研究選擇紫杉醇作為內標物符合要求。

本研究結果顯示，DTX在大鼠體內的血藥濃度有所增加，消癌平對DTX的多個藥動學參數有較大影響，結合其余參數結果，消癌平對多西紫杉醇的消除具有明顯的抑制作用，提示兩藥在聯合使用時，需嚴格的把握藥物的劑量，保障患者用藥的安全和有效。本團隊將在此次試驗和前期研究[8，20]的基礎上，繼續采用HPLC法探尋DTX與其他的抗腫瘤中藥注射劑(如：注射液香菇多糖、康艾注射液)之間潛在的藥動學和藥效學等多種形式的藥物相互作用。