牛奶中大腸桿菌對抗生素的耐藥性研究*

劉海鋒，張艷嬌， 廖小微，孫豐慧，代 敏， 郭莉娟△

1.成都醫學院 檢驗醫學院(成都 610500)；2.成都醫學院 四川省動物源性獸藥殘留防控工程實驗室 (成都 610500)

牛乳營養豐富、易于吸收、經濟方便，適用于嬰幼兒和青少年的生長發育，有利于骨質疏松、高血脂癥等疾病的治療，在人類飲食生活中扮演著重要的角色[1]。目前，牛乳的污染主要來源于致病菌、鮮乳腐敗變質和化學毒物，其中牛乳的腐敗變質主要是由細菌引起，主要來源于牛體自身的大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)最為常見，可分解鮮乳中的乳糖、蛋白質等營養物質，使牛乳產生酸味和惡臭，不可食用[2]。隨著科技的發展，抗生素的種類和使用量逐漸變多[3]，許多牧場主為了提高牛的免疫力，預防乳房炎等疾病，使用多種抗生素，部分場主甚至違反規定，不合理使用抗生素，使牛乳房內自帶的微生物菌群產生相應的耐藥性，加之牛乳加工操作、運輸和貯存等不規范，使耐藥菌殺滅不徹底或細菌的再污染，通過食物鏈傳播給人類，致使抗生素失效，嚴重威脅到人類健康。抗生素的大量使用和牛對抗生素的少量吸收，使其大部分隨牛體排出體外，從而使牛場中含有抗生素或攜帶耐藥基因的牛糞污和廢水通過還田利用、灌溉和堆糞，導致環境中其他細菌的耐藥性提高并加速耐藥基因的擴散[4]。因此，E.coli作為牛乳房內常見細菌和在食品衛生檢測中重要指標菌，分析牛乳源E.coli的對抗生素耐藥和耐藥基因攜帶情況，有重要意義。本實驗從不同牧場的牛乳中，分離出牛乳源E.coli，測定其對11種抗生素的耐藥情況，檢測20種耐藥基因，探究E.coli抗生素耐藥表型和基因型之間的關系，為牧場抗生素的選擇、正確使用和牛乳中E.coli污染防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

從不同牛奶養殖場分別采集樣品兩次，第1次從綿陽某養殖場隨機采集奶牛生牛奶樣品55個，第2次從成都青白江區某養殖場隨機采集正常奶牛生牛奶樣品19個，總共74個樣品。樣品用100 mL無菌離心管采集后裝入冰盒中帶回，并于24 h內處理完畢。

1.2 實驗藥品

1.2.1 培養基與試劑 蛋白胨水(BPW)、伊紅美藍培養基(EMB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)、瓊脂糖凝膠購于北京陸橋技術有限責任公司；水解酪蛋白瓊脂培養基(MHA)購于英國OXOID公司；0.5麥氏單位比濁管、Taq DNA聚合酶、PCR相關試劑及DNA Marker購于成都擎科生物科技有限公司。

1.2.2 藥敏紙片 β內酰胺類：奧格門汀(AMC，20 μg/片)、氨芐西林(ampicillin，AMP，10 μg/片)；頭孢類：頭孢曲松 (ceftriaxone，CRO，30 μg/片)、頭孢西丁(FOX，30 μg/片)、頭孢呋辛(CXM，30 μg/片)、 頭孢唑啉(CZO，30 μg/片)；氨基糖苷類：丁胺卡那(AMK，30 μg/片)、慶大霉素(gentamicin，GEN，10 μg/片)；四環素類：四環素(tetracycline，TET， 30 μg/片)；磺胺類：磺胺異噁唑(SIZ，300 μg/片)；氟喹諾酮類：環丙沙星(ciproflfl oxacin，CIP， 5 μg/片)； 11種藥敏紙片均購于杭州微生物試劑有限公司。

1.2.3 引物合成E.coli16S rDNA引物、抗生素耐藥性基因的20對引物均由擎科生物技術公司合成。具體各耐藥基因引物為β-內酰胺酶類：blaTEM、blaSHV、blaCTX-M，氨基糖苷類：aac(6′)-Ib、aph(3′)-IIa、aac(3)-IIa、ant(3″)-Ia，四環素類：tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(E)、tet(M)，磺胺類sul1、sul2、sul3，喹諾酮類：qnrA、qnrB、qnrS、qepA[5]。

1.3 E.coli的分離鑒定

分別取25 mL牛奶樣品置于225 mL BPW中，劇烈搖晃，然后取50 mL加入無菌三角燒瓶中，加入50 mL雙倍麥康凱液體培養基，37 ℃培養18 h后，劃線至EMB瓊脂平板上，35 ℃培養24 h，挑取菌落形態為有紫色或黑色中心且具有的金屬光澤的菌落劃線至TSA上，最后挑取3～5個單菌落至TSB中，培養18 h后保存于含20%的甘油內，于-80 ℃冰箱保存。分別挑取上述菌落，擴增16S rDNA(引物為27F和1 492R)， 擴增產物由成都擎科生物技術公司測序后于Gene Bank 中Blast進行序列比對,與其他E.coli同源率為99%的，則確定為大腸桿菌。

1.4 抗生素耐藥表型檢測

采用紙片擴散(K-B)法測定E.coli對11種抗生素的耐藥性。培養結束后，觀察是否形成均勻的圓形抑菌環，直接量取各種抗生素紙片周圍抑菌環直徑，測量結果精確到毫米，并記錄數據。參照上述標準判斷E.coli對各抗生素的敏感、中介和耐藥情況。質控菌株為E.coliATCC?25922，E.coliATCC?25928。

1.5 抗生素耐藥基因檢測

1.5.1 模板制備 蘸取表型耐藥菌株-80 ℃保存的E.coli及質控菌株純培養物菌液，劃線接種于TSA培養基上，37 ℃培養16～24 h。煮沸法制備模板，用無菌棉簽刮取過夜培養的菌苔，加入 700 μL煮沸10 min，在離心機中以12 000 r/min，離心半徑6.8 cm，離心2 min，取上清液作為PCR模板。

1.5.2 PCR反應體系與循環條件 PCR擴增體系：金牌Mix12.5 μL，10 μmo1/L的上下游引物各1 μL，上述制備的E.coliDNA模板2.5 μL，無菌去離子水8 μL，最終總體積為25 μL。PCR擴增循環條件：95 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，退火溫度根據引物設定，并持續10 s，以72 ℃延伸10 s,進行25個循環，最后72 ℃延伸5 min。擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

2 結果

2.1 E.coli的分離情況

本研究中74份牛奶樣品中共分離出E.coli43株，分離率為58.11%。

2.2 E.coli對抗生素的耐藥率

43株E.coli對抗生素耐藥率分別為AMC(97.67%)、AMP(51.16%)、TET(25.58%)、CRO(2.33%)、FOX(18.60%)、CXM(2.33%)、CZO(16.28%)、AMK(0.00%)、GEN(11.63%)、SIZ(23.26%)、CIP(6.98%)。E.coli耐藥范圍廣泛，但對于不同的抗生素耐藥率差異較大，E.coli對AMC耐藥率最高(97.67%)，對CZO中介率最高(32.56%)，中介率為0的有6個，對四種抗生素敏感率超過90.00%，分別是AMK(100.00%)、CRO(97.67%)、CXM(97.67%)和CIP(93.02%)(表 1)。

表 1 E. coli對11種抗生素的耐藥率(%，n=43)

注：S：敏感；I：中質；R：耐藥

2.3 E.coli的抗生素的耐藥譜

43株E.coli對11種抗生素均產生了耐藥性，共有產生了18種耐藥譜，譜型較分散，其中耐2種抗生素的菌株有15株(34.88%)，多重耐藥菌株有15株(34.88%)，以耐β內酰胺類、四環素類、氨基糖苷類、磺胺類最多，達6.98%，有1株E.coli的耐藥種類達到9種(表 2)。

表2 E. coli的抗生素的耐藥譜

2.4 E.coli對抗生素的耐藥基因檢測結果

43株耐β-內酰胺類抗生素E.coli菌株分別進行blaTEM、blaSHV、blaCTX-M基因的PCR檢測，所有基因均有檢出，檢出率分別為blaTEM(25.58%)、blaSHV(18.60%)、blaCTX-M(9.30%)。

5株耐氨基糖苷類抗生素E.coli菌株分別進行aph(3′)-IIa、aac(3)-IIa、ant(3″)-Ia基因的PCR檢測，檢出率分別為aph(3′)-IIa(40.00%)、aac(3)-IIa(60.00%)、ant(3″)-Ia(100.00%)。

11株耐四環素類抗生素E.coli菌株分別進行tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(E)、tet(M)基因的PCR檢測，僅檢測出tet(A)、tet(E)、tet(M)3種基因被檢測出，其檢出率分別為：54.55%、18.18%、90.91%。

10株耐磺胺類抗生素的E.coli菌株分別進行sul1、sul2、sul3基因的PCR檢測，除sul1基因尚未檢出，sul2和sul3的檢出率分別為30.00%和50.00%。

3株耐喹諾酮類抗生素的E.coli菌株分別進行qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib基因的PCR檢測，所有基因均有檢出，其檢出率分別為：qnrA(66.67%)、qnrB(66.67%)、qnrS(66.67%)、qepA(66.67%)、aac(6′)-Ib(100.00%)(圖1)。

圖1 大腸桿菌抗生素耐藥基因檢檢出情況

2.5 耐藥表型與基因型的關系

在43株E.coli中共檢測出16種不同的抗生素耐藥基因組合，3種或3種以上的組合占比皆為4.17%，共占25.02%，其中基因組合最復雜的菌株涉及到13種抗生素耐藥基因，僅氨基糖苷類基因未檢出，在耐4種及4種以上抗生素的菌株檢測中，均檢出3種及3種以上的耐藥基因，耐藥基因檢出種類與耐藥表型成正比(表 3)。

表3 大腸桿菌中抗生素抗性基因分布

注：S：敏感；I：中質；R：耐藥

3 討論

3.1 牛乳中E. coli對抗生素的耐藥性

E.coli可通過自身的快速分裂、突變、防御系統，能夠迅速獲得耐藥性，加之可通過質粒轉移耐藥基因，使細菌對抗生素的耐藥性進一步提高，已引起廣泛的關注。戴秀美等[6]對我國部分地區豬源E.coli的耐藥性研究發現，各地豬源E.coli對抗生素的耐藥均較高，幾乎沒有不耐藥的地區。在本實驗研究中，43株E.coli對各類廣譜抗菌藥的耐藥性各不相同，除了β內酰胺類耐藥率高于50.00%，其余抗生素的耐藥率基本低于25.00%，在18種耐藥譜中，多數為低耐，與田瑞等[7]、毛福超等[8]對豬源、禽源E.coli的高耐藥率、高耐藥譜檢出明顯不同，根據朱小玲等[9]年不同動物源E.coli對15種抗生素的抗藥性研究，奶牛場的E.coli平均耐藥性最低，只有18.7%，與本實驗結果基本一致。β內酰胺類藥物多用于各大牧場，通過乳房注射的方法來預防和治療奶牛的乳腺炎，致使牛乳中易有該類抗生素的殘留，并形成耐藥菌，本實驗中E.coli對AMC的耐藥率高達97.67%，說明兩大牧場對AMC的嚴重依賴，可以合理采用其他種類的抗生素來提高牛群的機體能力，如喹諾酮類抗生素：環丙沙星、恩諾沙星，本實驗中E.coli對該類抗生素的耐藥率僅為7.00%。牧場對牛群的抗生素使用，直接影響牛乳中E.coli的耐藥性，加工過程中殺菌不徹底或運輸、貯存等不規范，最終將增強人類腸道菌群的耐藥性，降低各類抗生素的臨床治療效果，影響人類健康。

3.2 牛乳中E. coli抗生素耐藥基因的檢測分析

E.coli作為常見的腸內細菌，其耐藥譜廣泛，對多種抗生素都呈耐藥性，涉及到耐藥基因有磺胺類、喹諾酮類、四環素類、氨基糖苷類、β-內酰胺酶類等基因，E.coli對不同種類抗生素有著不同的耐藥機制。

磺胺類抗生素主要通過干預細菌葉酸的合成代謝，從而抑制細菌的生長繁殖，而細菌可能通過質粒介導產生有抗性的二氫葉酸合成酶來利用葉酸，根據王娜等[10]的研究，sul基因可介導細菌對磺胺類抗生素的耐藥。在寇宏等[11]研究中，均檢測出3種sul基因，并呈現以sul3基因為主，sul1、sul2基因為輔的耐藥基因搭配。本實驗雖尚未檢出sul1基因，但結果基本一致。喹諾酮類抗生素主要通過被動擴散、磷脂滲透，進入細菌體內，與拓撲異構酶或DNA 促旋酶結合從而產生抑菌作用[12]，而細菌對其主要的耐藥性來源為染色體上的基因突變，研究者[13]發現基因Qnr，促使E.coli對CIP的耐藥性提高。本實驗喹諾酮類基因檢出率為(66.67%～100.00%)，說明類耐藥菌的耐藥基因豐富，喹諾酮類抗生素的治療效果將會明顯下降，此類基因由質粒介導而廣泛分布，但交叉耐藥性較少。四環素類抗生素在細菌體內阻礙氨酰tRNA與核糖體的結合來抑制蛋白質的合成，從而達到抑菌目的，而細菌的耐藥性主要依靠主動外排機制或核糖體保護機制[14]。在本實驗中tet(M)的檢出率高達90.91%，而外排泵基因只有兩個被檢出，說明該類耐藥菌主要依靠核糖體保護機制來產生耐藥性，這與許多研究所發現tet(A)基因的高檢出率略有不同。氨基糖苷類抗生素主要通過作用細菌體內的核糖體，抑制蛋白質的合成，導致細菌裂解死亡[15]，而細菌可利用具有鈍化作用的修飾酶，如：氨基糖苷類乙酰轉移酶(AAC)、核苷轉移酶(ANT)、磷酸轉移酶(APH)等使抗生素失去抗菌活性。本實驗耐藥菌株的氨基糖苷類基因檢出率為(40.00%～100.00%)，與黃琴[16]對廣州26株豬源E.coli耐藥菌的研究結果一致。β-內酰胺酶類抗生素通過抑制青霉素結合蛋白，干擾細菌細胞壁肽聚糖的合成，而腸內細菌內廣泛分布的SHV、TEM、CTX-M型[17]β-內酰胺酶，能直接分解青霉素、單環β-內酰胺類等抗生素。本實驗β-內酰胺類基因檢出率為(9.30%～25.58%)，與薛原等[18]發現基本一致，3種基因的檢出率皆較低，但根據表型所呈現的耐藥性，說明介導該類耐藥菌耐藥的基因以不局限于這傳統的ESBLs基因。根據有關研究[19]表明碳青霉烯酶和質粒介導的AmpC，如：blaNDM-1、blaCIT等基因都可介導該類耐藥菌的耐藥。

本實驗各基因型均有不同程度的檢出，基因組合的種類相對較多(共有16種)且差異很大，兩種或兩種以下的組合較多，表明部分耐藥基因分布廣泛，但還未呈現較高的聯合耐藥，合理交替使用不同種類的抗生素，能達到良好的抑菌效果，通過耐藥表型與基因型對比可發現，介導E.coli產生耐藥性的耐藥基因或方式還有很多，E.coli通過自然篩選，防御抗生素的基因種類或方法將會越來越多，未來抗生素的耐藥研究將更加嚴峻。

3.3 E. coli耐藥性的防控措施

控制牛乳中E.coli的耐藥性惡化，最終仍要落實到牧場對牛群的抗生素使用，在遵守法律法規的前提下，及時掌握牛群的耐藥譜，根據牛群感染的不同微生物，對癥下藥，而非盲目用藥，積極采取輪換用藥，能夠充分提高抗生素的使用效率。目前，我國大力推進中西醫結合，已經有研究[20]表明部分中草藥，不僅能殺滅和抑制細菌，而且與抗生素聯合使用，能產生協同抗菌和增效的作用。積極研發抗生素替代品，如：噬菌體試劑、益生素等能有效的改善各抗生素耐藥率增高的現狀。