shRNA干擾Nod樣受體蛋白在新生大鼠腦缺血再灌注模型中的作用及機制*

穆 清,楊丹丹，楊 盛，張志良

南陽醫專第一附屬醫院 心內科 (南陽473058)

心腦血管疾病是臨床常見病、多發病，臨床上經常出現“腦心綜合癥”、“心腦綜合癥”，可見兩者的病變發生發展密不可分。Nod樣受體蛋白(nod-like receptor protein 3, NLRP3)炎性小體，屬于NOD樣受體(NLR)家族，能識別病原體和損傷相關分子的胞內識別受體(PRR)[1]。研究[2-3]表明，受刺激的NLRP3與凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和前半胱天冬酶-1相互作用，組裝成大的胞漿復合物，激活半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)，促進IL-1β的成熟和分泌，從而參與各種炎癥性疾病的發展，如結腸炎[4]、乳腺炎[5]、急性腎損傷[6]、心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)損傷[7]。 I/R損傷是經常發生的一種損傷[8]，但是NLRP3在腦缺血再灌注模型(MCAO)建立之后對I/R的影響及其機理仍待研究。本實驗采用新生大鼠構建MCAO，探討sh-NLRP3對新生大鼠MCAO的心肌損傷、免疫反應方面的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級新生7日齡SD大鼠，體重(17.5±2.5) g，雌雄不限，購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號為SCXK (京) 2014-0001(合格證號：0015675)。新生大鼠每籠10～15只飼養于標準籠內，雌性親代大鼠自由喂養。

1.2 試劑與儀器

NLRP3的shRNA重組慢病毒(sh-NLRP3)由上海吉凱基因化學技術公司提供，上海博亞生物技術有限公司測序，滴度為109 TU/mL；增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)單克隆抗體購自北京中山生物技術公司；水合氯醛、心肌酶生化檢測試劑購自上海復興長征生化制劑公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司； TRIzol試劑盒、反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自美國ThermoFisher公司；一抗、二抗均購自英國Abcam公司；RIPA裂解液購自美國Sigma公司； ECL試劑盒購自上海碧云天生物科技公司；PCR儀、電泳儀及半干轉膜儀均購自美國伯樂公司；Gel View 6000化學發光凝膠成像系統購自廣州云星儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備動物模型 動物模型的建立參照[9-12]報道的方法，用頸外動脈插入線栓法制作MCAO。大鼠麻醉后，無菌手術結扎左側頸總動脈和頸外動脈，然后夾閉頸內動脈，在頸總動脈殘端剪一小口，插入栓線，固定好栓線，結扎頸內動脈。大鼠清醒后，出現手術對側肢體癱瘓、站立不穩、轉圈運動時，提示模型建立成功。

1.3.2 分組給藥 本實驗分為4個小組：正常組大鼠、MCAO組、MCAO+陰性對照假手術(Scramble)組、MCAO+sh-NLRP3組，每組10只。其中，假手術組和MCAO組大鼠尾靜脈給予滅菌生理鹽水0.1 mL； MCAO+Scramble組大鼠尾靜脈給予NLRP3空質粒0.1 mL； MCAO+sh-NLRP3組大鼠尾靜脈給予含sh-NLRP3的慢病毒質粒0.1 mL。

1.3.3 RT-PCR 用Trizol試劑提取各組心肌組織總RNA，用反轉錄試劑盒合成NLRP3的cDNA，進行PCR擴增后，根據熒光定量PCR試劑盒對cDNA進行檢測，以GAPDH為內參。實驗所用引物由上海生工設計合成。

1.3.4 蛋白質印跡技術(Wertern blot) 用RIPA蛋白裂解液于冰上提取大鼠心肌組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度并調平。取等量蛋白質用12% SDS-PAGE分離后轉移到PVDF膜。再用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，以1∶1 000的濃度加入一抗，4 ℃孵育過夜棄去，加入對應二抗，室溫封閉2 h后，滴加ECL于暗室曝光顯影。

1.3.5 HE染色 取各組大鼠心臟組織，用4%多聚甲醛室溫固定，制備4 μm厚的石蠟切片。然后進行HE染色，鏡下觀察。

1.3.6 免疫組織化學 對1.3.5所制作的石蠟切片進行免疫組化染色，操作嚴格按照試劑盒說明進行。染色結果顯示陽性細胞核有棕色顆粒沉著，顯微鏡下隨機選取5個不同視野，計算每個視野Ki67陽性率=Ki67陽性細胞/總細胞數×100%。

1.3.7 TUNEL染色 對1.3.5所制作的切片進行TUNEL染色。顯微鏡下隨機選取5個不同視野，計算每個視野凋亡率=TUNEL陽性細胞/總細胞數×100%，取平均數。

1.3.8 Elisa 頸動脈插管取血2 mL，室溫放置10～20 min后，離心速度2 000 r/min， 離心半徑10 cm，離心20 min，收集上清液嚴格按照試劑盒說明書檢測心損標記物肌紅蛋白(Mb)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白(cTnⅠ)、心肌炎標記分子白介素-1β(IL-1β)、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)表達水平。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 sh-NLRP3對4組大鼠心肌組織中NLRP3表達的干擾作用

與Ctrl組相比較，MCAO組和MCAO+Scramble組大鼠心肌組織中NLRP3表達量均有明顯上升，差異有統計學意義(P<0.01)；而MCAO+sh-NLRP3組大鼠心肌組織中NLRP3表達量比MCAO組明顯減少(P<0.01)(圖1)。

2.2 sh-NLRP3對4組大鼠心肌病理損傷的比較

與Ctrl組相比較，MCAO組和MCAO+Scramlbe組鏡下觀察明顯可見心肌細胞核消融、消失和成纖維細胞浸潤等病理學改變，而MCAO+sh-NLRP3組心肌細胞未見明顯異常(圖2)。

圖1 sh-NLRP3對4組大鼠心肌組織中NLRP3表達的干擾作用

注：A：RT-PCR檢測心肌組織中NLRP3的mRNA表達水平，與Ctrl組相比較，**P<0.01; 與MCAO組相比較，##P<0.01；B： Western blot檢測心肌組織中NLRP3的相對蛋白表達水平，與Ctrl組相比較，**P<0.01; 與MCAO組相比較，##P<0.01

圖2 HE染色檢測心肌組織病變(400×)

2.3 sh-NLRP3對4組大鼠心肌組織Ki67、PCNA表達的影響

MCAO組和MCAO+Scramlbe組細胞胞漿被染成棕黃色的細胞比例基本相當，但比Ctrl組明顯降低(P<0.01)；而MCAO+sh-NLRP3組Ki67陽性細胞率較MCAO組有明顯上調(P<0.01)(圖3A～B)。與Ctrl組相比較，MCAO組和MCAO+Scramlbe組均低表達Ki67、PCNA(P<0.01)；而MCAO+sh-NLRP3組心肌組織中兩者的表達水平較MCAO組卻又明顯上升(P<0.01)(圖3C)。

圖3 sh-NLRP3對4組大鼠心肌組織Ki67、PCNA表達的影響(400×)

注：A：免疫組化檢測各組心肌組織中Ki67；B： Ki67陽性細胞數統計結果，與Ctrl組相比較，**P<0.01，與MCAO組相比較，##P<0.01；C：Western blot檢測心肌組織中Ki67、PCNA相對蛋白表達水平，與Ctrl組相比較，**P<0.01，與MCAO組相比較，##P<0.01

2.4 sh-NLRP3對4組大鼠心肌細胞凋亡的影響

與Ctrl組相比較，MCAO組和MCAO+Scramlbe組鏡下TUNEL陽性細胞數量明顯增多，而MCAO+sh-NLRP3組則明顯較少。與Ctrl組相比較，MCAO組和MCAO+Scramlbe組細胞凋亡率明顯上升(P<0.01);而MCAO+sh-NLRP3組凋亡率較MCAO組明顯下降(P<0.01)(圖4A～B)。與Ctrl組比較，MCAO組和MCAO+Scramlbe組心肌組織高Caspase-3、Caspase-9(P<0.01)；而MCAO+sh-NLRP3組心肌組織中兩者的表達水平較MCAO組有明顯下降(P<0.01)(圖4C)。

圖4 sh-NLRP3對4組大鼠心肌細胞凋亡的影響(400×)

注：A： TUNEL檢測心肌組織細胞凋亡情況；B：細胞凋亡統計結果，與Ctrl組相比較，**P<0.01，與MCAO組相比較，##P<0.01；C： Western blot檢測各組Caspase-3和Caspase-9的相對蛋白表達水平及其統計結果.與Ctrl組相比較，**P<0.01，與MCAO組相比較，##P<0.01

2.5 sh-NLRP3對4組大鼠心肌損傷標記物含量的影響

與Ctrl組相比較，MCAO組和MCAO+Scramlbe組心肌組織中Mb、cTnⅠ和CK-MB的表達明顯上調(P<0.01)；而MCAO+sh-NLRP3組心肌組織中三者的表達水平較MCAO組明顯下降(P<0.01)(圖5)。

2.6 sh-NLRP3對4組大鼠TGF-β1、P-NF-κB p65和下游TNF-α表達的影響

MCAO組和MCAO+Scramlbe組心肌組織中TGF-β1、P-P65/P65和TNF-α的表達水平比Ctrl組明顯升高(P<0.01)；而MCAO+sh-NLRP3組中三者的表達水平較MCAO組明顯降低(P<0.01)(圖6)。

圖5 sh-NLRP3對4組大鼠心肌損傷標記物含量的影響

注：A：心肌組織中Mb的ELISA檢測結果，與Ctrl組相比較，**P<0.01，與MCAO組相比較，##P<0.01； B：心肌組織中CK-MB的ELISA檢測結果，與Ctrl組相比較，**P<0.01，與MCAO組相比較，##P<0.01；C：心肌組織中cTnⅠ的ELISA檢測結果，與Ctrl組相比較，**P<0.01，與MCAO組相比較，##P<0.01

圖6 sh-NLRP3對4組大鼠NF-κB p65磷酸化、TGF-β1和TNF-α表達的影響

注：A： Western blot檢測TGF-β1、P-P65/P65和TNF-α的相對蛋白表達水平；B：TGF-β1、P-P65/P65和TNF-α的相對蛋白表達水平的統計結果，與Ctrl組相比較，**P<0.01，與MCAO組相比較，##P<0.01

2.7 sh-NLRP3對4組大鼠心肌炎標記分子表達的影響

與Ctrl組相比較，MCAO組和MCAO+Scramlbe組IL-1β、iNOS、IL-6的表達水平明顯上調(P<0.01)，IL-10則明顯下調(P<0.01)；而與MCAO相比較，MCAO+sh-NLRP3組下調IL-1β、iNOS、IL-6，而上調IL-10 表達(P<0.01)(圖7)。

圖7 sh-NLRP3對4組大鼠心肌炎標記分子表達的影響

注：與Ctrl組比較，**P<0.01，與MCAO組比較，##P<0.01

3 討論

缺血性心臟病是全世界最致命的病因之一，I/R損傷是治療該疾病難以克服的難題，目前并沒有一種有效保護心臟免受I/R損傷的治療方案。因此，迫切需要對I/R損傷的分子機制和潛在治療方法進行研究[13-14]。通過抑制/沉默機體某些基因表達，可能是疾病治療的新方法，研究者[15]采用siRNA對新生MCAO大鼠腦損傷起保護作用。而Bauer等[16]研究表明，葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導活化NLRP3炎癥小體，進而促進成熟IL-1β的釋放，最終引發嚴重的腸道炎癥，而NLRP3基因敲除小鼠可以有效的避免DSS誘導的結腸炎的發生。基于此，本課題采用新生大鼠建立MCAO，探討sh-NLRP3對MCAO新生大鼠的保護作用。

研究[17]表明，心肌細胞在哺乳動物出生后迅速停止增殖，而另外的研究[18]則表明心肌細胞具有一定的再生能力。心肌細胞凋亡和壞死與嚴重心臟病如心力衰竭、心肌梗死和I/R損傷有關[19]。研究[20]表明，NLRP3炎癥小體的激活先于心肌損傷和凋亡的發生，而其對I/R損傷的細胞損傷和炎癥反應具有調節作用，在NLRP3基因敲除大鼠體內，缺血引起的梗死面積明顯減小[21-24]。除此之外，NLRP3對多種細胞的增殖有很大的影響，其下調可促進P2X7R表達和淋巴細胞生長，而表達增強可抑制細胞增殖并誘導凋亡[25]，敲除NLRP3基因可明顯減少心臟細胞凋亡發生[26]。本課題研究也表明sh-NLRP3能有效改善模型大鼠心肌壞死，減少細胞凋亡、促進心肌細胞的增殖再生能力。

作為機體復雜生理反應的一部分，細胞內炎癥微環境的改變在各類疾病發生發展過程中越來越被重視。NLRP3參與多種促炎因子的激活，包括IL-1β、IL-18和TNF-α[27]，心肌I/R損傷患者血漿中IL-18明顯升高，其表達水平與心肌功能障礙的嚴重程度直接關系[28]。嚴重I/R損傷大鼠高表達NLRP3，同時大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β及血漿中cTnⅠ的表達明顯升高，心肌細胞凋亡率升高，表明NLRP3與上述分子及I/R損傷發生密切相關[29]。本文研究發現得出類似的結果，sh-NLRP3能明顯減少MCAO新生大鼠心肌細胞損傷標記物的含量，降低炎癥因子表達，從而減輕MCAO模型建立造成的心肌損傷，這點從HE染色和TUNEL染色可以得到更直觀的反映。

NF-κB信號通路是炎癥反應的關鍵轉錄因子，通常情況下以無活性狀態被保存在細胞質中，可被多種刺激激活，通過與基因啟動子和增強子(如TGF-β、TNF-α、IL-1β等)結合，參與機體內多種靶基因的調控[30-32]。如TNF-α活化NF-κB增加lncRNA Lethe的表達，上調的lncRNA Lethe與NF-κB結合來阻斷靶基因的激活，達到減少炎癥因子的作用[33]。通過調節NF-κB/TGF-β1/Smada2途經，3種補肺腎顆粒對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠炎癥反應和氣道重塑表現出明顯的抑制作用[31]。激活NF-κB后誘導TGF-β1表達可以調節腸上皮細胞的遷移作用[34]。本文研究表明，sh-NLRP3可以抑制MCAO新生大鼠心肌組織中TGF-β1、P-P65/P65和TNF-α的表達，即sh-NLRP3抑制NF-κB信號通路活化，從而對MCAO誘導的心肌損傷和免疫反應產生抑制作用。

綜上所述，本研究以MCAO新生大鼠為研究對象，初步探討sh-NLRP3對模型大鼠心肌損傷和免疫反應的保護作用及其機制，豐富了MCAO中心肌損傷數據，為圍產期并發癥及心肌缺血/再灌注損傷等疾病提供了一些理論基礎。